一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒。所述试剂盒包括包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的微孔反应板，重组斜带石斑鱼生长激素蛋白标准品，铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，所述斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术提供的试剂盒可以检测斜带石斑鱼血清或垂体裂解液等样品中的生长激素浓度，检测灵敏度可达到0.131ng/mL，为石斑鱼生长激素的研究提供了有效的检测手段。

A kit for quantitative detection of growth hormone in grouper based on time-resolved fluorescence immunoassay

The present invention discloses a growth hormone specific quantitative detection kit based on time resolved fluorescence immunoassay technique for grouper grouper. The kit includes coated microplates of Epinephelus coioides growth hormone specific single chain monoclonal antibodies, recombinant Epinephelus coioides growth hormone protein standard, europium labeled grouper growth hormone specific single chain monoclonal antibody, the grouper growth hormone specific single chain monoclonal antibody the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 shows, the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2. The kit provided by the invention can detect the concentration of growth hormone in grouper serum or pituitary lysate samples, the detection sensitivity can reach 0.131ng/mL, providing an effective method for the study of garrupa growth hormone.

【技术实现步骤摘要】
一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒
本专利技术涉及生物分析化学、纳米生物
，具体地，涉及一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒。
技术介绍
石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。斜带石斑鱼是我国南方及东南亚一带重要的经济养殖鱼类，肉质鲜美，市场价值高。石斑鱼的生长主要通过生长激素（Growthhormon，GH）调节。鱼类GH为不含糖基的蛋白质，由垂体远端的嗜酸性细胞合成分泌，为一级结构中含有两个二硫键的单链。同一目鱼类中，GH氨基酸组成同源性约为80%。斜带石斑鱼生长激素的cDNA全长为615bp，编码204个氨基酸，成熟肽含有187个氨基酸。鱼类GH参与营养物质的能量代谢，在鱼类生长、繁殖及渗透压调节等方面起到重要作用。检测斜带石斑鱼GH大多采用放射免疫分析、酶免疫分析、Westernblot等方法，但放射免疫分析会造成放射性污染，且试剂盒保存时间短。酶联免疫分析为定性或半定量方法。Westernblot操作繁琐，耗时长，通量小。时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是继放射免疫后标记物发展起来的一种技术，已成为生物医学研究和临床生化检验中一项重要的分析手段。TRFIA利用镧系荧光配合物作为荧光标记物标记配体或受体，发生免疫反应后，根据时间分辨荧光仪测到的最后产物中的荧光强度和相对荧光强度的比值，推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。利用镧系稀土离子荧光寿命长的特点，在每个激发光脉冲过后，通过时间延缓期，让短寿命的荧光衰变掉后，再记录稀土螯合物的荧光强度，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高灵敏度。TRFIA具有操作简便、储存时间长、无放射性污染、试剂盒稳定性好、检测不受样品本底荧光干扰、标准曲线范围宽、应用范围广等优点。非常适合定量要求高，重复性好、需批量处理的检测样品。目前TRFIA技术已广泛应用于多种临床检测项目中，但运用该技术检测斜带石斑鱼GH尚无文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，所述抗体的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的制备方法为：将重组斜带石斑鱼GH蛋白免疫新西兰大耳兔，提取兔血淋巴细胞RNA，反转录构建噬菌体单链单克隆抗体库，使用重组斜带石斑鱼GH蛋白筛选特异性单链抗体，并转入pET32a+质粒中进行表达纯化。一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的微孔反应板，重组斜带石斑鱼生长激素蛋白标准品，铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，所述斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。所述铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的制备方法为，将斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体进行Eu3+标记，抗体与Eu3+标记物的质量比例为6:1。重组斜带石斑鱼生长激素蛋白标准品为：用含50mMTris-HCl、0.9%NaCl、0.02%BSA、0.05%NaN3、0.05%Tween-20，pH7.8的缓冲液，将重组斜带石斑鱼GH蛋白配制成0ng/mL、0.244ng/mL、0.977ng/mL、3.906ng/mL、15.625ng/mL、62.6ng/mL、250ng/mL系列浓度的校准溶液，按每份500uL配制，现配现用。本专利技术提供的基于时间分辨荧光免疫分析技术和异源性抗体的罗非鱼生长激素定量检测试剂盒还包括分析缓冲液、洗涤液、增强液。优选地，所述分析缓冲液为50mMTris-HCl、0.9%NaCl、0.02%BSA、0.05%NaN3、0.05%Tween-20，pH7.8的缓冲液。优选地，所述洗涤液（25×）由1.25MTris-HCl、22.5%NaCl、5%Tween-20、0.625%NaN3，pH7.8的分析缓冲液组成。优选地，斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体包被96孔微孔板的方法为：用包被缓冲液稀释斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体至适当浓度，4℃过夜包被至96孔微孔板，用封闭缓冲液封闭过夜，弃去封闭液，拍干保存；其中包被缓冲液为：pH8.0的50mMTris-HCl缓冲液；封闭缓冲液为含有0.05%NaN3、1%BSA，15%蔗糖的pH7.8的50mMTris-HCl缓冲液。本专利技术的测定方法为：往包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的96孔微孔反应板中加入100μL系列浓度梯度稀释的GH标准品或待检样品，25℃反应1h，用洗涤液洗板6次，拍干，再加入100μL1:200倍稀释的铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，25℃震荡孵育反应1h，用洗涤液洗板6次，拍干，最后加入200uL每孔的增强液，室温振摇5min后，在时间分辨荧光检测仪上按照所编程序测定。本专利技术的试剂盒的特别适合的检测对象为鱼血清、组织细胞裂解液或细胞孵育液，定量检测溶液中的斜带石斑鱼生长激素含量。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术建立了夹心法测定样品中的斜带石斑鱼生长激素水平，测试灵敏度可以达到0.131ng/mL，为石斑鱼生长激素的研究提供了有效的检测手段。附图说明图1是PCR扩增产物的电泳鉴定图；从图1可见PCR扩增了一段长约582bp的序列。图2为质粒构建酶切分析图，酶切后相应大小处有条带。图3为重组斜带石斑鱼GH蛋白表达纯化及Westernblot验证；重组GH纯化，M：marker、1：菌体裂解、2：破碎上清、3：包涵体、4-6：200mM咪唑洗脱。纯化得到约23.24kD的目的蛋白。His抗体验证，在相应大小处有条带。图4为多克隆抗体效价验证；A图为M：marker、重组GH蛋白上样量从1-3分别为100ng、50ng、10ng。B图为斜带石斑鱼垂体裂解蛋白10μL（1/10个斜带石斑鱼垂体，鱼体重约为800g）。图5是3F7号克隆的测序结果及预测氨基酸序列；下划线部分为Linker序列。图6是斜带石斑鱼GH特异性单链单克隆抗体表达和纯化；M：marker、N：未诱导对照、1：菌体裂解、2：破碎上清、3：包涵体、4：200mM咪唑洗脱。纯化得到约52kD的目的蛋白。图7是斜带石斑鱼GH标准曲线；A图：系列浓度梯度稀释的GH标准品和血清稀释（1:2/4/8）的曲线基本平行，B图：使用梯度稀释的重组斜带石斑鱼Somatolactin蛋白（Gp-SL）及Prolactin蛋白（Gp-PRL）、重组罗非鱼TSHβ蛋白（Ti-TSHβ）进行测定，结果表明重组斜带石斑鱼Somatolactin蛋白、Prolactin蛋白及重组罗非鱼TSHβ蛋白稀释曲线不与标准曲线平行且测定值较低，说明无交叉反应。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.权利要求1所述的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将重组斜带石斑鱼GH蛋白免疫新西兰大耳兔，提取兔血淋巴细胞RNA，反转录构建噬菌体单链单克隆抗体库，使用重组斜带石斑鱼GH蛋白筛选特异性单链抗体，并转入pET32a+质粒中进行表达纯化。3.一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的斜带石斑鱼生长激素特异性定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的微孔反应板，重组斜带石斑鱼生长激素蛋白标准品，铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，所述斜带石斑鱼生长激素特异性单...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文笙，覃靖凯，
申请(专利权)人：中山大学，中山大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44