抗活性型GIP抗体制造技术

本发明专利技术提供一种能够高精度地检测活性型GIP的抗活性型GIP抗体。本发明专利技术涉及一种抗体，其为结合于活性型GIP，且与非活性型GIP实质上不结合的抗活性型GIP抗体，其中，至少识别选自序列号5表示的氨基酸序列的第8～10号的氨基酸中的1种以上，且在H链上包含由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域。EMNPSDGRTHFNE  (1)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗活性型GIP抗体
本专利技术涉及一种与活性型GIP特异性地反应的抗体其利用。
技术介绍
GIP(肠抑胃肽(Gastricinhibitorypolypeptide)或葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptide))为属于胰高血糖素(glucagon)-胰泌素(secretin)家族的消化道激素之一。GIP与GLP-1(胰高血糖素样肽1)一起称为肠促胰岛素(incretin)，在脂质或糖质的摄食时由存在于小肠的K细胞分泌。已知GIP会促进胰岛β细胞的胰岛素分泌，并激发胰岛素存在下的脂肪细胞对葡萄糖的摄入。因此，也认为GIP的作用成为肥胖的一个主要原因，实际上，有抑制GIP的功能与抑制肥胖的报告(非专利文献1)。进一步，报告有GIP成为胰岛素抵抗性的原因之一(非专利文献1)。在胰岛素抵抗发病时，由胰岛素导致的糖的吸收作用降低，其结果，引起高胰岛素血症。高胰岛素血症也据说是与以肥胖为首的各种的生活习惯病的发病有关的根本原因，从生活习惯病的风险减轻的方面出发，胰岛素抵抗性的预防和改善也很重要。另外，已知GIP具有胃酸分泌抑制作用或胃运动抑制作(专利文献1～3)，认为GIP的上升抑制对饭后的消化促进或胃积食的改善有效。因此，测定血液中的GIP的浓度在这样的疾病或其治疗药的评价方面很重要。但是，已知在GIP中存在具有生理活性的活性型和不具有生理活性的非活性型。即，在人方面，前原GIP(prepro-GIP)由分布于胃、十二指肠、小肠上部的K细胞受到处理而成为活性型GIP(也记为“GIP(1-42)”)，其后，通过由DPP-4将N末端的2个氨基酸切断而成为非活性型的GIP(也记为“GIP(3-42)”)。因此，生物体内GIP的定量通过测定活性型和非活性型的总量，不能准确地得知治疗药的效果或生活习惯病的风险等。一直以来，作为测定活性型GIP的手段，市售有活性型GIP定量试剂盒(IBL公司)，但存在以下问题：1)饭后的血中活性型GIP浓度高于该试剂盒的定量界限；2)稀释率不同的情况下的变动系数超过10％；3)稀释率越高，测定值越升高。另外，最近，报道有将由GIP(1-42)的N末端侧6个氨基酸残基构成的肽作为免疫原制作的抗活性型GIP单克隆抗体利用ELISA法可以定量5～4000pg/mL浓度的活性型GIP(非专利文献2)。另外，报道有将由GIP(1-42)的N末端侧7个氨基酸残基构成的肽作为免疫原制作的抗活性型GIP单克隆抗体利用ELISA法定量7～500pg/mL浓度的活性型GIP(专利文献4)。(专利文献1)国际公开第01/87341号(专利文献2)日本特表2006-213598号公报(专利文献3)日本特开平5-95767号公报(专利文献4)日本特开2013-138638号公报(非专利文献1)MiyawakiK等，NatMed.8(7)：738-42，2002(非专利文献2)：JasonS.Troutt等，ClinicalChemistry，57(6)：849-855(2011)
技术实现思路
本专利技术涉及以下的1)～3)。1)一种抗体，其为结合于活性型GIP且与非活性型GIP实质上不结合的抗活性型GIP抗体，其中，至少识别选自序列号5表示的氨基酸序列的第8～10号的氨基酸中的1个以上，且在H链上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域。EMNPSDGRTHFNE(1)2)一种活性型GIP的检测或测定方法，其使用上述1)的抗体。3)一种活性型GIP的检测或测定试剂，其含有上述1)的抗体。附图说明图1是使用了本专利技术的抗活性型GIP抗体的夹心ELISA的标准曲线。图2是使用了本专利技术的抗活性型GIP抗体的健康人人血中活性型GIP的定量。对照食及试验食摄取后的(A)血中GIP(1-42)、(B)血中总GIP值(N＝5，同以被验者的交叉试验)。(C)饭后GIP(1-42)相对于总GIP的比例(％)图3本专利技术抗活性型GIP抗体的表位分析。具体实施方式本专利技术涉及提供一种能够高精度地检测活性型GIP的抗活性型GIP抗体。本专利技术人等对特异性地识别活性型GIP的抗体的获取进行了各种研究，其结果识别了与迄今为止的抗体不同的表位，并成功取得具有高特异性的新型的抗活性型GIP抗体。通过使用本专利技术的抗体，可以以高精度将活性型GIP与非活性型GIP区别从而进行检测。因此，根据本专利技术，可以进行生物体试样中的活性型GIP的测定、活性型GIP值的异常的检测、进而以活性型GIP作为指标的治疗药的奏效性评价等。另外，通过计算活性型GIP相对于总GIP的比例，可以估计DPP-4活性。本专利技术中“活性型GIP”是指哺乳类的活性型GIP，优选为人的活性型GIP。人活性型GIP为由42个的氨基酸构成的肽(“GIP(1-42)”)(序列号5)。另一方面，“非活性型GIP”是指活性型GIP的N末端的2个氨基酸(YA)被切断后的肽(“GIP(3-42)”)。本专利技术中的抗活性型GIP抗体为结合于活性型GIP且与非活性型GIP实质上不结合的抗体。与非活性型GIP实质上不结合可以通过使用蛋白质印迹(westernblotting)、免疫沉淀、免疫组织化学染色、及ELISA等方法测定被验抗体和非活性型GIP的结合来进行判断。具体而言，如果在将被验抗体相对于活性型GIP的结合量设为100％的情况下，被验抗体相对于的非活性型GIP的结合量至多为10％以下，优选5％以下，进一步优选1％以下，进一步更优选0.1％时，则可以认为其“与非活性型GIP实质上不结合”。另外，利用夹心ELISA(sandwichELISA)的测定中，相对于非活性型GIP溶液，可以使用例如抗总GIP抗体作为捕捉抗体、生物素标记抗活性型GIP单克隆抗体作为检测抗体来进行。另外，本专利技术的抗体为识别活性型GIP(序列号5)的N末端至第8号以后的氨基酸的抗体，为至少识别选自第8～10号(SDY)中的1个以上的氨基酸的抗体。进一步，本专利技术的抗体在H链上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域。EMNPSDGRTHFNE(1)(1)中的字母文字是指氨基酸的一种文字标记，序列以从N末端至C末端方向的顺序记载。在此，I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，F表示苯基丙氨酸，V表示缬氨酸，A表示丙氨酸，T表示苏氨酸，D表示天门冬氨酸，Q表示谷酰胺，E表示谷氨酸，M表示蛋氨酸，N表示天门冬酰胺，P表示脯氨酸，S表示丝氨酸，G表示甘氨酸，R表示精氨酸，H表示组氨酸。在本专利技术中，“保守序列突变”是指对由突变前的氨基酸序列构成的抗体的反应性不产生显著的影响或不使其改变的氨基酸突变。这样的保守序列突变中包含1～多个，优选为1～3个，更优选1个的氨基酸的取代、加成及缺失。作为进行了该保守序列突变的氨基酸序列，可列举与突变前的氨基酸序列具有90％以上，优选为95％以上，进一步优选为98％以上的序列同一性的氨基酸序列。该突变可以利用部位特异的变异诱发及PCR介导变异诱发那样的本
中公知的标准的技术而导入到本专利技术的抗体中。作为保守氨基酸取代，可举出将氨基酸残基取代为具有类似的侧链的氨基酸残基(氨基酸残基的家族)。该氨基酸残基的家族在本
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【技术保护点】
一种抗体，其中，该抗体为结合于活性型GIP且与非活性型GIP实质上不结合的抗活性型GIP抗体，所述抗体至少识别选自序列号5表示的氨基酸序列的第8～10号的氨基酸中的1个以上，且在H链上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域，EMNPSDGRTHFNE(1)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 JP 2014-2588491.一种抗体，其中，该抗体为结合于活性型GIP且与非活性型GIP实质上不结合的抗活性型GIP抗体，所述抗体至少识别选自序列号5表示的氨基酸序列的第8～10号的氨基酸中的1个以上，且在H链上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域，EMNPSDGRTHFNE(1)。2.根据权利要求1所述的抗体，其中，包含由序列号2表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域作为H链可变区。3.根据权利要求2所述的抗体，其中，保守序列突变后的氨基酸序列为与序列号2表示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的序列。4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，包含由序列号2表示的氨基酸序列或其保守序列突变构成的区域作为H链可变区，且包含由序列号4表示的氨基酸序列或其保守序列突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：福冈大介，大崎纪子，下丰留玲，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP