一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，公开了一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法。本发明专利技术所述制备方法利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；将免疫抗原免疫产蛋鸡，取鸡蛋蛋黄提取抗体，获得卵黄抗体粗提物；将卵黄抗体粗提物进行纯化，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。本发明专利技术通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体、抗体纯化等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素卵黄抗体。

Preparation method of glucagon egg yolk antibody

The invention relates to the technical field of immunology, and discloses a preparation method of glucagon egg yolk antibody. The preparation method of the invention using carbon two imine method of glucagon was conjugated with bovine serum protein, immune antigen; immune antigen to immunize laying hens, egg yolk antibody obtained from extraction, egg yolk antibody extracts; yolk antibody will crude extracts were purified by glucagon yolk purified antibody. The present invention by glucagon and bovine serum protein coupled to form antigen and antigen antibody immune optimization, extraction, antibody purification process, to obtain high titer antibody, the amount of glucagon yolk antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法
本专利技术涉及免疫学
，具体涉及一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
胰高血糖素(升糖素)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，是由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素，它具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高，1mol/L的激素可使3×106mol/L的葡萄糖迅速从糖原分解出来。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。胰高血糖素分泌过多会使血糖浓度增大，所以2型糖尿病的发生与发展中不仅是胰岛素功能和分泌异常所致，胰高血糖素也在发挥重要作用，而且也可能是糖尿病发病的一个独立因素。胰高血糖素异常升高是导致2型糖尿病患者血糖偏高的重要因素，检测胰高血糖素水平有助于临床准确判断糖尿病患者病情。目前已知检测胰高血糖素的方法主要是放射性免疫法(RIA)，也有报道采用胰高血糖素单抗依据免疫学原理进行检测的方法，如专利CN105116140A。卵黄抗体是近年来受到广大关注的一个方向，通过免疫母鸡得到免疫后的鸡蛋，从鸡蛋中提取抗体。单抗的制备具有不确定性，细胞的融合与亚克隆的过程中都有可能出现不可预料的现象，如果出现这些现象都要进行重新去做。而卵黄抗体很少会出现这种不可控现象，相比单抗其操作简单，稳定性好，得到的产率较高。卵黄抗体是一种生产工艺较为简单的廉价抗体，具有较强的耐酸耐碱耐热能力。一般的卵黄抗体的制备方法与多克隆抗体的制备方法相同，区别在于卵黄抗体避免提取动物血清，只需从鸡蛋中获取。然而这种一般的制备方法用来制备胰高血糖素抗体，其抗体量较少。目前，尚没有关于制备胰高血糖素卵黄抗体的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，使得所述制备方法能够提高卵黄抗体量，并且具备较高的效价。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，包括：步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；步骤2、将免疫抗原免疫产蛋鸡，取鸡蛋蛋黄提取抗体，获得卵黄抗体粗提物；步骤3、将卵黄抗体粗提物进行纯化，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。针对现有工艺中缺少胰高血糖素卵黄抗体的制备方法的问题，本专利技术通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体、抗体纯化等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素卵黄抗体。作为优选，步骤1为：称取胰高血糖素和N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于DMF中，再加入DCC反应，反应液离心后收取上清液，将上清液滴加到溶有BSA的缓冲液中进行反应，然后将所得反应液透析，得到免疫抗原。在本专利技术具体实施过程中，步骤1为：称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmolN-羟基琥珀酰亚胺完全溶于1ml的DMF中，再加入0.12mmol的DCC，置于4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液10000r/min离心10min，离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有2mmolBSA的PBS中，4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。作为优选，步骤2为：步骤2.1、将免疫抗原免疫产蛋鸡；步骤2.2、取免疫鸡蛋蛋黄采用PEG6000三步提纯法进行粗提纯，获得卵黄抗体粗提物。在本专利技术具体实施过程中，步骤2为：步骤2.1、将免疫抗原免疫产蛋鸡；步骤2.2、将所得的免疫鸡蛋消毒清洗，鸡蛋破壳，收集蛋黄并除去残留卵白蛋白，破卵黄膜收集卵黄液，加入3倍卵黄液体积的含有3.5％PEG6000的PBS，搅拌均匀后4℃下过夜；第二天离心取上清液，过滤，在滤液中加入固体PEG6000至最终浓度为12％，搅拌均匀，在4℃下离心弃去上清液，收集沉淀部分，获得卵黄抗体粗提物。其中，步骤2.1可具体如下：首次免疫采用弗氏完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，在产蛋鸡的双翅、胸肌位置采用多点注射；其余四次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，共免疫五次；每次间隔15天，免疫剂量为0.5ml/只；从第二次免疫后开始收集免疫鸡蛋。作为优选，步骤3为：将卵黄抗体粗提物用饱和硫酸铵法纯化，最后进行透析，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。在本专利技术具体实施过程中，步骤3为：将卵黄抗体粗提物用PBS溶解，搅拌下加入固体硫酸铵至最终浓度为50％饱和度，4℃静置过夜；离心后，弃去上清液，收集沉淀部分以少量PBS溶解，边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为33％，4℃静置2h，10℃离心，收集沉淀，将沉淀溶用PBS中进行透析，每隔12h换一次透析液，透析三天，收集透析袋中液体，真空冷冻干燥，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。采用常规的卵黄抗体制备方法与本专利技术所述方法进行对比，结果显示，本专利技术所述制备方法能够获得较多的胰高血糖素卵黄抗体，并具备较高的效价。同时，和其他蛋白偶联形成的免疫抗原相比，本专利技术胰高血糖素和牛血清蛋白偶联形成免疫抗原更适合制备高效价、高抗体量的卵黄抗体。由以上技术方案可知，本专利技术通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体、抗体纯化等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素卵黄抗体。附图说明图1所示为本专利技术所述的免疫抗原与BSA电泳检测图；其中，1为免疫抗原，2为BSA；图2所示为本专利技术制备的胰高血糖素卵黄抗体粗提物和纯品的电泳图；其中，1为粗提物，2为纯品；图3所示为本专利技术制备的胰高血糖素卵黄抗体效价图。具体实施方式本专利技术公开了一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下就本专利技术所提供的一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法做进一步说明。实施例1：本专利技术制备胰高血糖素卵黄抗体的方法1、免疫抗原合成称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)完全溶于1ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入0.12mmol的二环己基碳二亚胺(DCC),置于4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。第二天把反应液10000r/min,10min离心,离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有BSA(2mmol)的PBS(8ml,10mmol,PH7.4)中，4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。将所得反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析(PBS，0.01mol/LPH7.4)三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。免疫抗原电泳检测(图1)，结果显示，免疫抗原的电泳图与BSA相比发生了明显变化，说明半抗原与载体蛋白偶联成功。2、卵黄抗体粗提免疫抗原免疫产蛋母鸡(白羽鸡)，首次免疫采用弗氏完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，在产蛋鸡的双翅、胸肌位置采用多点注射；其余四次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，共免疫五次；每次间隔15天，免疫剂量为0.5ml/只；从第二次免疫后开本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；步骤2、将免疫抗原免疫产蛋鸡，取鸡蛋蛋黄提取抗体，获得卵黄抗体粗提物；步骤3、将卵黄抗体粗提物进行纯化，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。

【技术特征摘要】
1.一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；步骤2、将免疫抗原免疫产蛋鸡，取鸡蛋蛋黄提取抗体，获得卵黄抗体粗提物；步骤3、将卵黄抗体粗提物进行纯化，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1为：称取胰高血糖素和N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于DMF中，再加入DCC反应，反应液离心后收取上清液，将上清液滴加到溶有BSA的缓冲液中进行反应，然后将所得反应液透析，得到免疫抗原。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1为：称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmolN-羟基琥珀酰亚胺完全溶于1ml的DMF中，再加入0.12mmol的DCC，置于4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液10000r/min离心10min，离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有2mmolBSA的PBS中，4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2为：步骤2.1、将免疫抗原免疫产蛋鸡；步骤2.2、取免疫鸡蛋蛋黄采用PEG6000三步提纯法进行粗提纯，获得卵黄抗体粗提物。5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，夏娜娜，吕瑞，梁雨昕，陈莹珊，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44