脱氢酶催化的FDCA的产生制造技术

本发明专利技术涉及表达具有5‑羟甲基‑2‑呋喃羧酸脱氢酶活性的多肽的细胞，以及表达具有呋喃化合物转运能力的多肽的细胞。本发明专利技术还涉及产生2,5‑呋喃‑二羧酸(FDCA)的方法，其中本发明专利技术的细胞用于氧化FDCA的呋喃前体。

Production of FDCA catalyzed by dehydrogenase

The present invention relates to the expression with 5 hydroxymethyl polypeptide 2 furoic acid dehydrogenase activity of the cells, and the expression of polypeptide has the ability of transport of furan compounds. The invention also relates to the production of 2,5 furan two carboxylic acid (FDCA) method, in which the cells of the invention for furan precursors for FDCA oxidation.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脱氢酶催化的FDCA的产生专利
本专利技术涉及酶学、分子遗传学、生物转化和发酵
特别地，本专利技术涉及将5-(羟甲基)-2-糠酸氧化为5-甲酰-2-糠酸的脱氢酶，及涉及编码这种脱氢酶的多核苷酸及其在羟甲基糖醛至2,5-呋喃二羧酸的生物转化中的应用。专利技术背景2,5-呋喃二羧酸(FDCA)是一种单体化合物，其可以用于产生具有巨大经济影响的聚酯。在该领域中一个非常重要的化合物是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，其是从对苯二甲酸(PTA)和乙二醇产生的。FDCA在聚酯PET中可代替PTA，在这种情况中产生聚呋喃二甲酸乙二醇酯(PEF)。PEF具有在聚酯大市场中代替PET的良好潜力。不仅是因为当其与PET相比时具有更优秀的性质，还因为其可以衍生自可再生原料。FDCA可以通过化学(DeJongetal2012.In:BiobasedMonomers,Polymers,andMaterials；Smith,P.,etal.；ACSSymposiumSeries；AmericanChemicalSociety:Washington,DC)或者组合的化学-生物途径(Wiercksetal2011.ApplMicrobiolBiotechnol92:1095-1105)从糖产生。在后者的情况中，单体糖如葡萄糖或果糖被化学转化为5-(羟甲基)-2-糠醛(HMF)，其随后可以由酶氧化为FDCA。从HMF中产生FDCA的生物途径已经基于HMF降解株CupriavidusbasilensisHMF14的分离(Wierckxetal2010.MicrobialTechnology3:336-343)而开发。鉴别了编码在C.basilensisHMF14中参与HMF降解途径的酶的基因簇及在恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌株中异源表达相关基因(Koopmanetal2010.PNAS107:4919-4924)，由此获得代谢HMF的能力。降解途径的第一个氧化步骤包括形成5-(羟甲基)-2-糠酸(HMFCA)，其随之被氧化为5-甲酰-2-糠酸(FFA)及进一步氧化为FDCA。在随后的研究中(Koopmanetal2010.BioresourceTechnology101:6291-6296及WO2011/026913)，仅编码HMF氧化还原酶的C.basilensisHMF14的hmfli基因被导入恶臭假单胞菌中。所述氧化还原酶主要对于HMFCA作为氧化酶，但是其也可以氧化HMF或FFA。仅hmfli基因的异源表达可以使恶臭假单胞菌从HMF产生FDCA。在进一步优化的研究中(Wierckxetal2011,supra；及WO2012/064195)，两个另外的基因在恶臭假单胞菌中表达，其分别编码HMFCA转运蛋白和具有未知特异性的醛脱氢酶。然而，从HMF产生FDCA的氧化酶催化途径与脱氢酶催化途径相比具有一些固有的缺点，包括至少产生毒性H2O2、缺少从氧化步骤获得能量和不佳的O2亲和性及相关的系统高需氧量。因此，本专利技术的目的是通过提供用于从呋喃前体如HMF产生FDCA的新的脱氢酶催化途径的手段和方法，以及提供在这种方法中使用新的HMFCA转运蛋白的手段和方法，从而解决上述这些缺点。专利技术概述在第一方面，本专利技术涉及包含表达核苷酸序列的表达构建体的细胞，所述核苷酸序列编码具有与SEQIDNO:1-11任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的脱氢酶，其中所述表达构建体可以在细胞中表达，及与没有所述表达构建体的相应野生型细胞相比，所述脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)氧化为5-甲酰-2-糠酸(FFA)的能力。优选地，所述细胞进一步具有：a)醛脱氢酶活性，其将呋喃醛氧化为相应呋喃羧酸，其中优选所述细胞包含第二表达构建体，表达编码包含与SEQIDNO:24、25、26、27、28、29和30任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的醛脱氢酶的核苷酸序列，其中第二表达构建体可以在细胞中表达，及与没有第二表达构建体的相应野生型细胞相比，所述醛脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中如下至少一种能力：i)将5-羟甲基糠醛(HMF)氧化为HMFCA，ii)将DFF氧化为FFA，及iii)将FFA氧化为FDCA；及b)将呋喃化合物转运进/转运出细胞的能力，其中优选所述细胞包含第三表达构建体以表达编码具有将至少FDVIFCA转运进细胞的能力的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:17、31、32、33和34任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列，其中第三表达构建体可以在细胞中表达，及与没有第三表达构建体的相应野生型细胞相比，所述多肽的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将至少FDVIFCA转运进细胞的能力。另一方面，本专利技术涉及包含表达编码具有将至少HMFCA转运进细胞的能力的多肽的核苷酸序列的表达构建体的细胞，所述多肽包含与SEQIDNO:17氨基酸序列具有至少86.5％相同性的氨基酸序列，其中所述表达构建体可以在细胞中表达，及与没有所述表达构建体的相应野生型细胞相比，所述多肽的表达至少赋予所述细胞或增加所述细胞中将至少HMFCA转运进细胞的能力，及其中所述细胞进一步包含将HMF转变为FDCA的酶，其中将HMF转变为FDCA的酶优选包括如下至少一种：a)醇脱氢酶，其将HMFCA氧化为FFA及醛脱氢酶活性，其将呋喃醛氧化为相应呋喃羧酸；及b)氧化还原酶，其将HMF、2,5-二羟甲基呋喃、HMFCA、FFA和2,5-二甲酰呋喃的一或多种氧化为FDCA，及任选存在的醛脱氢酶活性，其将呋喃醛氧化为相应呋喃羧酸。本专利技术的细胞优选是微生物细胞，如细菌、酵母或丝状真菌细胞。本专利技术的酵母或丝状真菌细胞优选选自如下属：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、腐殖霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将5‑羟甲基‑2‑呋喃羧酸(HMFCA)氧化为5‑甲酰‑2‑糠酸(FFA)的方法，所述方法包括将细胞在存在FDVIFCA、优选在有益于细胞氧化FDVIFCA的条件下孵育的步骤，其中所述细胞包含表达构建体，所述表达构建体用于表达编码具有与SEQ ID NO:1‑11所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的脱氢酶的核苷酸序列，及其中所述表达构建体可以在所述细胞中表达，并且与在没有所述表达构建体的相应野生型细胞中相比，所述脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将FDVIFCA氧化为FFA的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.17 EP 15155401.11.一种将5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)氧化为5-甲酰-2-糠酸(FFA)的方法，所述方法包括将细胞在存在FDVIFCA、优选在有益于细胞氧化FDVIFCA的条件下孵育的步骤，其中所述细胞包含表达构建体，所述表达构建体用于表达编码具有与SEQIDNO:1-11所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的脱氢酶的核苷酸序列，及其中所述表达构建体可以在所述细胞中表达，并且与在没有所述表达构建体的相应野生型细胞中相比，所述脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将FDVIFCA氧化为FFA的能力。2.一种产生FDCA的方法，所述方法包括将细胞在包含FDCA的一或多种呋喃前体的培养基中孵育的步骤，优选在有益于细胞将FDCA的呋喃前体氧化为FDCA的条件下进行，及任选回收FDCA，其中所述细胞包含表达构建体，用于表达编码具有与SEQIDNO:1-11所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的脱氢酶的核苷酸序列，其中所述表达构建体可以在所述细胞中表达，及与没有所述表达构建体的相应野生型细胞相比，所述脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将HMFCA氧化为FFA的能力，其中优选FDCA的至少一种呋喃前体选自HMF、2,5-二羟甲基呋喃(DHF)、HMFCA、FFA和2,5-二甲酰呋喃(DFF)，其中最优选HMF，及其中优选FDCA的呋喃前体得自一或多种己糖，优选得自木质纤维素生物质的一或多种己糖，优选通过酸催化的脱水获得。3.权利要求2的产生FDCA的方法，其中FDCA通过包括酸或盐沉淀、随后冷却结晶和/或溶剂提取的方法从培养基中回收。4.从一或多个FDCA单体产生聚合物的方法，所述方法包括如下步骤：a)根据权利要求2或3的方法制备FDCA单体，及b)从在a)中获得的FDCA单体产生聚合物。5.细胞用于将一或多种呋喃前体生物转化为FDCA的应用，其中优选FDCA的至少一种呋喃前体选自HMF、DHF、HMFCA、FFA和DFF，最优选HMF，其中所述细胞包含表达构建体，所述表达构建体用于表达编码具有与SEQIDNO:1-11所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的脱氢酶的核苷酸序列，及其中所述表达构建体可以在所述细胞中表达，及与没有所述表达构建体的相应野生型细胞相比，所述脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将HMFCA氧化为FFA的能力。6.细胞，其包含表达构建体，用于表达编码具有与SEQIDNO:1-11所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的脱氢酶的核苷酸序列，其中所述表达构建体可在所述细胞中表达，并且与没有所述表达构建体的相应野生型细胞相比，所述脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将HMFCA氧化为FFA的能力，并且其中所述细胞进一步具有如下至少之一：a)醛脱氢酶活性，其将呋喃醛氧化为相应的呋喃羧酸，其中优选所述细胞包含第二表达构建体，所述第二表达构建体用于表达编码包含与SEQIDNO:24、25、26、27、28、29和30所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列的醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述第二表达构建体可以在细胞中表达，并且与没有所述第二表达构建体的相应野生型细胞相比，所述醛脱氢酶的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中如下至少一种能力：i)将5-羟甲基糠醛(HMF)氧化为HMFCA，ii)将DFF氧化为FFA，及iii)将FFA氧化为FDCA；及b)将呋喃化合物转运进和/或转运出细胞的能力，其中优选所述细胞包含第三表达构建体，所述第三表达构建体用于表达编码具有将至少HMFCA转运进细胞的能力的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:17、31、32、33和34所示任一氨基酸序列具有至少45％相同性的氨基酸序列，其中所述第三表达构建体可以在细胞中表达，并且与没有所述第三表达构建体的相应野生型细胞相比，所述多肽的表达赋予所述细胞或增加所述细胞中将至少HMFCA转运进细胞的能力。7.权利要求6的细胞，其中所述细胞是微生物细胞，优选所述细胞是选自如下菌属的酵母或者丝状真菌细胞：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、腐殖霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma)，更优选是选自如下种的酵母或丝状真菌细胞：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、里氏木霉(Trichodermareesei)和产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)；或者优选所述细胞是选自如下菌属的细菌细胞：埃希氏菌属(Escherichia)、鱼腥藻属(Anabaena)、Aeribacillus、解硫胺素杆菌属(Aneurinibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、柄杆菌属(Caulobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、Desulfurispora、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、Pelotomaculum、假单胞菌属(P...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·J·鲁伊塞纳尔斯，
申请(专利权)人：普拉克生化公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL