通用甲基化分析方法技术

本发明专利技术提供了测定存在于已知序列的双链DNA的单链中的预定位置上的胞嘧啶残基是否是甲基化的方法以及用于实施该方法的化合物。本发明专利技术还提供了用于制备双链DNA的衍生物的方法，该方法包括使双链DNA与CPG甲基转移酶和s‑腺苷甲硫氨酸类似物接触。

General methylation analysis method

The present invention provides a method for determining whether a cytosine residue in a predetermined position in a single strand of a double stranded DNA of known sequences is methylated and a compound for the implementation of the method. The invention also provides a method for preparing double stranded DNA derivatives, which includes double stranded DNA and CPG methyltransferase and s S-adenosylmethionine analogue contact.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通用甲基化分析方法
本申请要求于2015年12月17日提交的美国序列号14/973,637和于2014年12月19日提交的美国临时申请号62/094,850的优先权，其内容在此通过引用以其整体并入本文。在整个本申请中，引用了多个出版物。这些引用的全部对比文件被直接放置在权利要求书的前面。这些出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入本申请中以更充分地描述本专利技术所涉及的现有技术。
技术介绍
DNA甲基化是具有多个调节功能(比如X染色体失活、基因组印迹和反转录转座的抑制)的重要的表观遗传学机制(GollandBestor2005)。这种甲基化方法涉及通过被称为DNA甲基转移酶(Mtases)的酶甲基从S-腺苷L-甲硫氨酸(AdoMet)转移到胞嘧啶(C)的C5碳以产生5-甲基胞嘧啶(5mC)(GollandBestor,2005)。人类基因组包含～2800万个CpG位点，其中约70％在胞嘧啶的5位处甲基化(爱德华兹等，2010(Edwardsetal.,2010))。异常或反常的DNA甲基化已经与越来越多的人类疾病有关，该人类疾病包括免疫缺陷、着丝粒不稳定(Centromereinst本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物，其具有以下结构：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 US 62/094,850;2015.12.17 US 14/973,6371.一种化合物，其具有以下结构：其中R是其中R1、R2和R3独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数，前提条件是，当R是且n为1时，R1、R2或R3中的至少一个不为H。2.根据权利要求1所述的化合物，其中R是其中R1和R2独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数，前提条件是，当R是或当R是且n为1时，R1或R2中的至少一个不为H。3.根据权利要求1所述的化合物，其中R是4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中R'是H或烷基。5.一种组合物，其包含具有以下结构的化合物：其中R是其中R1、R2和R3独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数，前提条件是，当R是且n为1时，R1、R2或R3中的至少一个不为H，所述化合物与CpG甲基转移酶相连接。6.根据权利要求5所述的组合物，其中R是：其中R1和R2独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数，前提条件是，当R是或当R是且n为1时，R1或R2中的至少一个不为H。7.根据权利要求5所述的组合物，其中R是8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中R'是H或烷基。9.根据权利要求5至8中任一项所述的组合物，其中所述化合物与所述CpG甲基转移酶的活性位点相连接。10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。11.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。12.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。13.一种产生双链DNA的衍生物的方法，其包含使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触：其中R是能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物上转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化学基团，其是在使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合的条件下进行，从而产生所述双链DNA的衍生物，其中R具有以下结构：其中R1、R2和R3独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数，前提条件是，当R是且n是1时，R1、R2或R3中的至少一个不为H。14.根据权利要求13所述的方法，其中R具有以下结构：其中R1和R2独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数，前提条件是，当R是或当R是且n为1时，R1或R2中的至少一个不为H。15.根据权利要求13所述的方法，其中R具有以下结构：16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中R'是H或烷基。17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。19.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中当能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合时，所述化学基团允许所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化学脱氨基化。21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述未甲基化胞嘧啶在序列中直接与所述双链DNA的单链中的鸟嘌呤邻接。22.一种确定存在于已知序列的双链DNA序列的单链中预定位置的胞嘧啶是否为未甲基化的方法，其包含：a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物：其中R是化学基团，所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合，从而制备衍生的双链DNA，其中R具有以下结构：其中R1、R2和R3独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数；b)通过光转化在步骤a)中产生的衍生物中C类似物来制备U类似物；c)独立地获得所述双链DNA的所述衍生物的单链；d)对在步骤c)中获得的所述单链进行测序；以及e)将在步骤d)中测定的所述单链的序列与没有产生衍生物的所述双链DNA的相应链的序列进行比对，其中在所述衍生物的所述单链中存在U类似物替代胞嘧啶类似物表明了在所述双链DNA的单链中的预定位置上的胞嘧啶是未甲基化的。23.根据权利要求22所述的方法，其中R具有以下结构：其中R1和R2独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH2、C(O)R'、CN、NO2、C(O)R'、S(O)2NHR'；其中X是O或NR'；其中R'是H、烷基或芳基；并且其中n是1至8的整数。24.根据权利要求22所述的方法，其中R具有以下结构：25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中R'是H或烷基。26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。27.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。28.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述胞嘧啶在序列中直接与所述双链DNA的所述单链中的鸟嘌呤邻接。30.根据权利要求22至29中任一项所述的方法，其中当能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合时，所述化学基团允许所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化学脱氨基化。31.根据权利要求22至30中任一项所述的方法，其中在步骤d)中所述测序是通过合成测序。32.根据权利要求31所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂莫西·H·贝斯托，静月·居，晓旭·李，詹姆斯·J·拉索，
申请(专利权)人：纽约哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国,US