本发明专利技术公开了小麦分子育种领域与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记及其应用。基于SNP标记及其侧翼序列开发出的3个位于小麦第3同源群的KASP标记(AX‑111578083、AX‑111624595和AX‑110772653)，能准确地对抗穗发芽候选位点进行分型，预测小麦的穗发芽抗性，从而更加方便地在实验室条件下对抗穗发芽材料进行鉴定和筛选。利用分子标记辅助选择育种技术能有效避免环境因素和人为误差对表型鉴定带来的影响，可与表型鉴定联合使用。本发明专利技术的3个KASP分子标记，能提供强选择位点，提高抗穗发芽育种材料选择的准确性，实现小麦抗穗发芽分子标记辅助选择育种的目标。
【技术实现步骤摘要】
与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学及作物育种
，具体地说，涉及与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记及其应用。
技术介绍
小麦是世界第三大粮食作物，仅次于水稻和玉米，在世界范围内广泛种植。小麦穗发芽(Pre-harvestSprouting,PHS)是指小麦在收获前遇到的连绵阴雨时，未及收获便在穗上发芽的一种现象。穗发芽是一种世界性的灾害，据报告，世界主要小麦栽培国如加拿在、日本、澳大利亚、中国均有严重穗发芽危害。我国有10大小麦主产区，主要以中国中部、东南部麦区如长江中下游麦区、西南麦区穗发芽危害更为严重，随着近年来降雨北移现象，我国北部穗发芽麦区如北部冬麦区也常有穗发芽现象发生。小麦籽粒在收获前的穗发芽不仅会带来大面积的粮食产量降低，也会导致小麦籽粒中水解等相关的酶活性迅速升高，降低籽粒中储藏物质含量，容重(testingweight)、出粉率和面粉降落值(Fallingnumber)下降，造成小麦各种加工食品品质恶化，且会影响小麦籽粒的储存。因此，选育具有穗发芽抗性的小麦资源对小麦育种具有重大的实际意义。分子标记辅助选择育种技术，是利用与目的性状候选基因连锁的分子标记，通过分子生物学检测候选基因分型，达到对目的性状选择的目的；其优点是简单快速，不受环境及环境互作的影响，能够快速且高效的选育出目标资源材料。单核苷酸的多态性(SNP,SingleNucleotidePolymorphisms),是指在基因组上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换(transition)、颠换(transversion)、缺失(deletion)和插入(insertion)。SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。主要有以下特点：1、数量多，分布广泛；2、适于快速、规模化筛查；3、等位基因频率的容易估计；4、易于基因分型。利用全基因组的SNP关联分析方法和候选基因的SNP方差分析的方法，可以找到与表型相关的SNP变异。KASP(竞争性等位基因特异性PCR,即KompetitiveAllele-SpecificPCR)技术是LGCGenomics公司的SNPline基因分型检测方案。该方案的核心是KASP技术，这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(InsertionsandDeletions，插入和缺失)。该项技术优点是：其一，只要合成两个通用荧光探针，两个通用淬灭探针，再加合成多个针对具体位点的SNPPCR引物，就可以测许多位点；其二，因为荧光探针、和淬灭探针都很贵，KASP方法相比于Taqman方法，可以通过通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本。因此，筛选出与抗穗发芽相关的SNP，并将其开发为能准确鉴定其SNP位点的KASP标记，对抗穗发芽材料选择，在选育小麦抗穗发芽材料，减小穗发芽对小麦的影响，提高小麦产量和品质等方面均有重要的意义。中国小麦分布地域辽阔，由于各地自然条件、种植制度、品种类型和生产水平存在着不同程度的差异，一方面形成了明显的种植区域，另一方面极大地丰富了中国地方品种的多样性。利用大规模来自全国各地的地方品种，对其在2012年到2015年不同环境的穗发芽表型鉴定，并进行全基因组的关联分析，鉴定到3个位于小麦第3同源群的与穗发芽表型相关的SNP标记。针对这3个分子标记展开进一步研究，并将此开发为可用于分子标记辅助选择育种的KASP标记，能有效提高小麦育种效率和准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记，共包含3个分子标记，①分子标记AX-111578083与抗穗发芽基因myb10-A1之间的遗传图距为0.35Mb；②分子标记AX-111624595与抗穗发芽区段R-loci之间的遗传图距为3.55Mb；③分子标记AX-110772653与抗穗发芽区段R-loci之间的遗传图距为3.73Mb。分子标记AX-111578083、AX-111624595和AX-110772653均来自中国地方品种小麦，分别位于中国春SURVEY序列(IWGSC2.28)3A染色体173.81Mb、3D染色体112.63Mb和112.80Mb，它们的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-3所示。本专利技术还提供基于KASP技术开发的用于扩增所述分子标记的引物，包括正向引物AL1、正向引物AL2和反向引物C。其中，扩增分子标记AX-111578083的引物序列分别如SEQIDNO:4-6所示，扩增分子标记AX-111624595的引物序列分别如SEQIDNO:7-9所示，扩增分子标记AX-110772653的引物序列分别如SEQIDNO:10-12所示。本专利技术还提供含有所述引物的用于鉴定与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记的检测试剂盒。本专利技术还提供所述分子标记、引物或试剂盒在小麦抗穗发芽材料创制中的应用。本专利技术还提供所述分子标记、引物或试剂盒在分子标记辅助小麦抗穗发芽选择育种中的应用。本专利技术进一步提供所述分子标记、引物或试剂盒在选育具有穗发芽抗性的小麦资源中的应用。包括以下步骤：1)提取待测小麦样品的DNA；2)取浓度为50-100ng/μl的模板DNA1.00μl，引物混合液0.14μl，KASPMasterMix5.00μl，50mM的MgCl2溶液0.08μl，H2O3.78μl，进行PCR扩增；引物混合液中正向引物AL1和正向引物AL2的终浓度均为10μM，反向引物C的终浓度为10μM；3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。步骤2)PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；第一步扩增反应：95℃变性20秒，68℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环；12℃保存。步骤3)具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型：等位位点AX-111578083-G为携有抗穗发芽优异等位类型植株，等位位点AX-111624595-C为携有抗穗发芽优异等位类型植株，等位位点AX-110772653-T为携有抗穗发芽优异等位类型植株。鉴定小麦抗穗发芽的引物以及检测小麦抗穗发芽能力强弱的方法在如下(a)-(e)中的应用也属于本专利技术的保护范围：(a)筛选抗穗发芽能力强的小麦品种。(b)筛选抗穗发芽能力弱的小麦品种。(c)培育抗穗发芽的小麦新品种。(d)所述3个KASP分子标记在小麦特异抗穗发芽材料创制中的应用。(e)所述3个KASP分子标记引物在小麦特异抗穗发芽材料创制中的应用。本专利技术小麦抗穗发芽候选位点及其分子标记是通过以下方法获得的：(1)通过收集来自中国10大麦区的272份地方品种小麦组成自然群体。(2)自然群体穗发芽多年多点鉴定于2012年-2015年在温江、雅安、崇州共6个不同的环境下，于蜡熟期收获小麦籽粒，将其悬挂于阴凉通风处自然风干7d后，进行人工脱粒。在有盖塑料培养皿中垫上用3-5ml蒸馏水润湿的滤纸进行发芽试验，试验设计三个重复，每个重复50粒种本文档来自技高网...
【技术保护点】
与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记，其特征在于，共包含3个分子标记，①分子标记AX‑111578083与抗穗发芽基因myb10‑A1之间的遗传图距为0.35Mb；②分子标记AX‑111624595与抗穗发芽区段R‑loci之间的遗传图距为3.55Mb；③分子标记AX‑110772653与抗穗发芽区段R‑loci之间的遗传图距为3.73Mb；3个分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。
【技术特征摘要】
1.与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记，其特征在于，共包含3个分子标记，①分子标记AX-111578083与抗穗发芽基因myb10-A1之间的遗传图距为0.35Mb；②分子标记AX-111624595与抗穗发芽区段R-loci之间的遗传图距为3.55Mb；③分子标记AX-110772653与抗穗发芽区段R-loci之间的遗传图距为3.73Mb；3个分子标记的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-3所示。2.基于KASP技术开发的用于扩增权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，包括正向引物AL1、正向引物AL2和反向引物C；其中，扩增分子标记AX-111578083的引物序列分别如SEQIDNO:4-6所示，扩增分子标记AX-111624595的引物序列分别如SEQIDNO:7-9所示，扩增分子标记AX-110772653的引物序列分别如SEQIDNO:10-12所示。3.含有权利要求2所述引物的用于鉴定与小麦抗穗发芽性状相关的KASP分子标记的检测试剂盒。4.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在小麦抗穗发芽材料创制中的应用。5.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在分子标记辅助小麦抗穗发芽选择育种中的应用。6.权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王际睿，周勇，唐豪，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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