透细胞质膜的传递制造技术

有效装载穿过细胞质膜的传递包括提供细胞群，将细胞群与一定体积的水溶液相接触。所述水溶液包括有效装载和浓度大于百分之五的醇类。水溶液的体积可以是细胞群暴露表面积的函数，或者使细胞群中细胞数目的函数。这里还描述了有关的组合物、仪器、系统、技术和物品。

Transmission of plasma membrane

The transmission of the effective load through the plasma membrane of the cell involves providing the cell population and contacting the cell population with a certain volume of aqueous solution. The aqueous solution comprises an effective load and a alcohol having a concentration greater than five percent. The volume of aqueous solution can be a function of the surface area of the cell population, or the function of the number of cells in the cell population. Compositions, instruments, systems, techniques, and articles are described here.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】透细胞质膜的传递相关申请本申请要求2014年10月24日递交的英国申请第1419013.6号、2014年10月24日递交的英国申请第1419012.8号和2014年10月24日递交的英国申请第1319011.0号的优先权。这些申请的全部内容在此通过引用明确的并入本文。
本专利技术涉及透细胞质膜传递的试剂。本专利技术的主题内容可以包括，例如，将分子、生物学和药理学治疗剂传递到目标区域，例如，细胞、组织或者器官。
技术介绍
尽管在一些领域已经有了技术上的发展，但是由于例如分子尺寸、分子电荷等因素的影响，将某些特定分子传递进入细胞仍然存在挑战。质膜或者细胞膜是一种半渗透性的生物膜，能够起到选择性隔离的作用，调节细胞的化学组成。因此，只有特定的某些分子可以通过被动扩散穿过质膜进入细胞。小的、疏水性的分子(例如，O2、CO2和N2)以及小的、不带电荷的极性分子(例如，H2O和甘油)可以通过被动扩散穿过质膜。大的、不带电的极性分子(比如氨基酸、葡萄糖，和核苷酸)和离子(比如H+、Na+、K+和Cl-)不能被动地扩散入细胞。
技术实现思路
本专利技术基于出乎意料的发现，即，通过将细胞与一种包含待传递化合物(例如，有效装载)和能够可逆的渗透或者溶解细胞膜的试剂的溶液相接触，所述化合物或者化合物的混合物(组合物)可以被传递到真核细胞的细胞质中。优选的，所述溶液以喷雾的形式被传递到细胞中，例如，五水和的颗粒。例如，所述细胞被喷雾包覆而不是将所述细胞渗透或者浸没在包含待传递化合物的溶液中。能够渗透或者溶解真核细胞膜的示范性的试剂包括醇类和去污剂，分别例如乙醇和TritonX-100。其他示范性的去污剂(例如，表面活性剂)包括聚山梨酸酯20(例如、吐温20)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺]丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)、十二烷基硫酸钠(SDS)，和辛基葡糖苷。用于实现包覆一群被包覆的细胞的情况的实施例包括传递微细细粉颗粒喷雾，例如，所述情况不包括向细胞上滴入或者通过移液管加入大量的溶液使细胞群基本上被渗透或者被大量流体淹没。因此，所述雾或者喷雾包括一定的液体体积与细胞体积比例。作为选择，所述情况包括雾或者喷雾的体积与暴露的细胞面积(例如，在基本上平的平面上，例如组织培养皿的底部，例如，组织培养皿的小孔中，例如，微滴定组织培养皿中，当细胞以交会层或者基本上交会层的形式存在时暴露的细胞膜面积)的比例。因此，有需要提供一种不含载体，例如不含病毒载体的方法用于传递生物学上相应的有效装载，例如，化合物或者组合物，使其穿过质膜进入细胞。“负载”或者“有效负载”是用于描述化合物或者组合物的术语，所述化合物或者组合物通过水溶液被传递穿过细胞质膜进入细胞内部。在一个方面中，将有效装载传递通过细胞质膜包括提供细胞群并将此细胞群与一定体积的水溶液接触。所述水溶液包括有效装载和醇类，含量大于5浓度百分比。所述水溶液的量可以是细胞群暴露表面面积的函数，或者可以是细胞群中细胞数目的函数。在另一个方面，用于传递有效装载通过细胞质膜的组合物包括一种水溶液，所述水溶液包括有效装载、浓度大约百分之5的醇，小于46mM的盐、小于121mM糖和小于19mM的缓冲剂。例如，所述醇类(例如，乙醇)浓度不超过50％。一个或者一个以上下列特征可以被归入以下任意可行的结合中。被传递到细胞中的液体的量可以是任意单位，例如，一喷雾；例如，在水性颗粒上的小滴。所述体积相对于单独的细胞或者相对于交会细胞群或者基本上交会的(例如，至少75％，至少80％交会；例如，85％、90％、95％、97％、98％、100％)细胞群体而描述的。例如，所述体积可以在每个细胞6.0x10-7微升至每细胞7.4x10-4微升之间。所述体积在每个细胞4.9x10-6微升和每细胞2.2x10-3微升之间。所述体积可以在每细胞9.3x10-6微升到2.8x10-5微升之间。.所述体积可以是大约1.9x10-5微升没细胞，并且大约是指在百分之10以内。所述体积在每个细胞6.0x10-7微升和每细胞2.2x10-3微升之间。所述体积可以在2.6x10-9微升每平方微米裸露表面面积到1.1x10-6微升每平方微米裸露表面面积之间。所述体积可以在5.3x10-8微升每平方微米裸露表面面积到1.6x10-7微升每平方微米裸露表面面积之间。所述体积可以是1.1x10-7微升每平方微米的暴露表面面积。大约可以是在百分之十之内。细胞的交会指的是细胞在一个表面上相互接触。例如，它可以被表示为一种估计的(或者计算的)百分比，例如，10％交会指的是10％的表面，例如，10％组织培养容器的表面被细胞覆盖，100％指的是完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、平皿或者烧瓶表面上两个维度上生长。非粘附细胞可以通过真空旋出、拉开，或者从细胞群顶部的组织培养基吸出，或者从容器的底部吸出或者真空除去。通过气推作用将水溶液形成喷雾，并以此将所述细胞群与大量水溶液相接触。所述气体可以是氮气、环境空气或者惰性气体。所述喷雾是一种离散单元，体积单位的直径在1纳米到100微米，例如，30-100微米范围内。所述喷雾包括直径大约在30-50微米范围内的离散单元。总体积为20微升的水溶液可以以喷雾形式被传递到大约1.9平方厘米被细胞占领的区域内，例如24-孔板的孔内。总体积为10微升的水溶液可以被传递到大约0.95平方厘米的被细胞占领的区域内，例如，一个48-孔板的孔中。通常，所述水溶液包括有效装载，可以穿过细胞膜进入细胞，并且第二体积是不包含有效装载的缓冲剂或者培养基。作为选择，第二体积(缓冲液或者培养基)还可以包含有效装载。在一些实施方案中，所述水溶液包括有效装载和醇类，和不包含醇(和选择性地不包含有效装载)的第二体积。在加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群之前，细胞群可以与所述水溶液接触0.1-10分钟。所述缓冲液或者培养基可以是磷酸盐缓冲液(PBS)。在加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群之前，细胞群可以与所述水溶液接触2秒-5分钟。所述细胞群可以与水溶液相接触，例如，与包含所述有效装载的水溶液接触30秒到2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基，例如，加入不包括有效装载的缓冲液或者培养基，从而浸没或者悬浮细胞群。在加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群之前，细胞群可以与所述喷雾接触1-2分钟。在向细胞喷雾和加入缓冲液或者培养基这段时间期间，所述细胞通过来自喷雾体的水汽层保持水合状态。所述水溶液可以包括5到30％的乙醇浓度。所述水溶液还可以包括75％到98％的水、2-45％的乙醇、6-91mM的蔗糖，2到35mM的氯化钾、2到35mM的乙酸铵和1到14mM的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(HEPES)中的一个或者一个以上。所述细胞群可以包括粘附细胞或者非粘附细胞。所述粘附细胞可以包括间充质干细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、肺细胞、神经元的细胞、成纤维细胞、人脐静脉(HUVEC)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和人胚肾(HEK)细胞或者固定细胞(比如，细胞系)中的至少一种。所述细胞群可以包括非粘附细胞。所述非粘本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于传递有效装载通过细胞质膜的方法，包括：提供细胞群；并且将所述细胞群与一定体积的水溶液接触，所述水溶液包括有效装载和醇类，浓度大于百分之5，其中，所述体积是：(i)接触的细胞群表面积；或者(ii)细胞群的细胞数目的函数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.24 GB 1419012.8;2014.10.24 GB 1419013.6;201.用于传递有效装载通过细胞质膜的方法，包括：提供细胞群；并且将所述细胞群与一定体积的水溶液接触，所述水溶液包括有效装载和醇类，浓度大于百分之5，其中，所述体积是：(i)接触的细胞群表面积；或者(ii)细胞群的细胞数目的函数。2.根据权利要求1所述的方法，其中，一定体积的水溶液以喷雾的形式被传递到细胞群。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每细胞6.0x10-7微升到每细胞7.4x10-4微升之间。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每细胞9.3x10-6微升到每细胞2.8x10-5微升之间。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每细胞4.9x10-6微升到每细胞2.2x10-3微升之间。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积是大约每细胞1.9x10-5微升，其中，所述大约是10％以内。7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述喷雾包括交替或者直接在1纳米到100微米之间的亚颗粒。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述颗粒的直径在30-100微米之间。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每平方微米接触表面积2.6x10-9微升到每平方微米接触表面积1.1x10-6微升之间。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每平方微米接触表面积5.3x10-8微升到每平方微米接触表面积1.6x10-7微升之间。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积是大约每平方微米接触表面积1.1x10-7微升，其中，所述大约是10％以内。12.根据权利要求1所述的方法，其中，通过气体推动水溶液形成喷雾实现将细胞群与一定体积的水溶液相接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述喷雾包括尺寸为直径30-100微米的体积离散单元。14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述喷雾包括尺寸为直径大约为30-50微米的体积离散单元，其中，所述大约是10％以内。15.根据权利要求1所述的方法，其中，总体积为20微升的水溶液被传递到大约1.9平方厘米的细胞占用面积中，其中，所述大约是10％以内。16.根据权利要求1所述的方法，其中，总体积为10微升的水溶液被传递到大约0.95平方厘米的细胞占用面积中，其中，所述大约是10％以内。17.根据权利要求1所述的方法，其中，将细胞群与所述水溶液接触0.1-10分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述缓冲液或者培养基包括磷酸缓冲盐水(PBS)。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群与水溶液接触2秒到5分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群与水溶液接触30秒到2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞群与水溶液接触1到2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液包括乙醇，浓度为5-30％。23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液包括一种或者一种以上的75％到98％的H2O，2％到45％的乙醇，6到91mM的蔗糖，2到35mM的氯化钾，2到35mM的醋酸铵，和1到14mM的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(HEPES)。24.根据权利要求12所述的方法，其中，所述气体包括氮气、室内空气或者惰性气体。25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群包括粘附细胞。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述粘附细胞包括主要或者固定的间充质干细胞、肺细胞、神经细胞、纤维母细胞、人脐静脉血管内皮细胞和人胚胎肾细胞(HEK)中的至少一个。27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群包括非粘附细胞。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非粘附细胞包括主要或者固定的造血干细胞(HSC)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子-诱导的杀伤(CIK)细胞、人脐带血CD34+细胞、B细胞中的至少一种。29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括小化学分子、肽或者蛋白质、或者核酸。30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述小化学分子的分子量小于1000道尔顿。31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述小化学分子包括MitoRedCMXRos、碘化丙啶、氨甲蝶呤、或者DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)。32.根据权利要求29所述的方法，其中，所述肽包括艾卡拉肽、利拉鲁肽和Icatiban。33.根据权利要求29所述的方法，其中，所述核酸包括小干扰性RNA(siRNA)。34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述siRNA分子的分子量大约为15000道尔顿。35.根据权利要求29所述的方法，其中，所述蛋白的分子量大约是1,000-150,000道尔顿。36.根据权利要求29所述的方法，其中，所述蛋白质包括抗体或其片段。37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述抗体或其片段包括抗-肌动蛋白抗体、抗-GAPDH抗体、抗-Src抗体、抗-Myc抗体和抗-Raf抗体。38.根据权利要求29所述的方法，其中，所述核酸分子的分子量大于5,000,000道尔顿。39.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括治疗剂。40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述治疗剂包括顺铂、阿司匹林、他汀、和氟西汀中的至少一个。41.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括诊断剂。42.根据权利要求1所述的方法，其中，所述诊断剂包括亚甲基蓝、专利蓝V，和吲哚菁绿中的至少一种。43.根据权利要求1所述的方法，其中有效装载包括荧光分子。44.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括可检测的纳米颗粒。45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述纳米颗粒包括量子点。46.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群是基本上交回的，其中，所述基本上是指大于75％的交回。47.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群形成单层细胞。48.用于将有效装载传递通过细胞质膜的组合物，所述组合物包括一种水溶液，所述水溶液含有有效装载、浓度大于百分之五的醇类、小于46mM的盐、小于121mM的糖和小于19mM的缓冲剂。49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和苯甲醇。50.根据权利要求48所述的组合物，其中所述盐选自由NaCl,KCl,Na2HPO4,C2H3O2NH4,和KH2PO4所组成的组中。51.根据权利要求48所述的组合物，其中所述糖包括蔗糖。52.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·马奎尔，S·奥戴，
申请(专利权)人：阿维塔斯有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰,IE