一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法技术

一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法。属于生物表面活性剂生产【技术领域】。该方法步骤为：（1）双相碳源优势菌株的选育：将铜绿假单胞菌CICC10204经活化及驯化培养后，筛选出双相碳源优势菌株；（2）菌种的扩大培养：将优势菌株经活化及扩大培养后得到二级种子液；（3）发酵培养：将二级种子液进行双碳源发酵培养；发；（4）分离提纯：将发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖；将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得鼠李糖脂工业化提纯品。本发明专利技术实现了鼠李糖脂精制品的工业化生产，最终纯化的鼠李糖脂经浓缩可达90%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法
本专利技术属于生物表面活性剂生产
，具体涉及一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法。
技术介绍
鼠李糖脂是由微生物在特定的生长条件下分泌的一种具有优良表面活性的代谢产物，是一种对环境无害的天然表面活性剂。近年来，随着鼠李糖脂在石油、农业、污染环境治理以及要求更高的日化、医药、食品等领域的成功实验应用，针对鼠李糖脂的研究也越来越广泛和深入。从生产菌种的选育、培养基配方的优化、发酵工艺及精制工艺的设计等，使鼠李糖脂在实验室水平的研究上日益成熟，提取的最高纯度可达95%以上，这些研究为鼠李糖脂的品质提高和应用领域的拓展提供了大量的科学依据。目前，鼠李糖脂发酵液的生产国内已实现工业化，但是纯度更高可应用于高端领域的鼠李糖脂精制品还处于实验室研究阶段，未能实现工业化，主要原因是由于工业化产脂较高的发酵液主要是以植物油作为碳源，而利用植物油为碳源生产的发酵液往往残油含量高，成品液体粘度大，乳化严重，常规方法难以破乳，要实现破乳就需要加入其他化学药剂，新加入成分又会给后续分离提纯带来极大困难，所以一直以来，以植物油为碳源的工业化生产的后续分离提纯问题仍没有解决，常用的可用于发酵液的分离提取方法也因为所得鼠李糖脂收率极低，精制成本过高而未能在工业上获得应用。针对残油含量高的问题，亦有通过改变碳源的方式来优化最终发酵液状态的研究，相关文献也报道了其他碳源如葡萄糖、甘油、乙醇等进行生产的实例，虽然这些研究从发酵液状态的角度解决 了残油高的问题，但是由于鼠李糖脂产生菌为铜绿假单胞菌，油性碳源更利于诱导表面活性物质的生成，而利用上述碳源生产的发酵液鼠李糖脂有效含量不高，产率低使得生产成本提高，这也是利用上述碳源其难以实现工业化的原因。鼠李糖脂尤其是精制品的工业化生产空白，严重制约了鼠李糖脂这一绿色环保的活性剂在更广泛领域的应用，所以亟需一种鼠李糖脂生产方法，一方面解决产脂含量低的问题，一方面解决后续分离提纯的问题。此外，对于发酵生产鼠李糖脂泡沫控制问题也是工业化难点，由于发酵过程产生大量的泡沫，泡沫的溢出直接影响发酵过程的完整性，往往由于泡沫量过大无法控制而导致发酵液溢出，一方面料液损失同时增加染菌机会，另一方面由于泡沫影响氧传递也使得发酵过程微生物处于异常代谢状态，导致产量下降或菌体自溶，所以鼠李糖脂工业化发酵泡沫控制问题也是实现稳定工业化发酵的关键，目前比较常用和有效的消泡方式是添加消泡剂或是利用机械搅拌桨消泡，消泡剂尤其是以发酵碳源作为消泡剂的消泡方式是比较有效的方式，如利用植物油作为消泡剂或是利用乙醇作为消泡剂，这里利用碳源作为消泡剂有一个风险就是用量的问题，如在大量泡沫产生的情况下，会导致消泡剂用量增加，对于植物油消泡就会导致发酵液残油量增加，影响发酵液状态增加分离纯化难度；而以乙醇为消泡剂的消泡方式如想在整个发酵过程完全控制泡沫，又容易出现乙醇加量过大的情况，导致菌体代谢异常或是菌体死亡，影响发酵正常进行，所以，对于工业发酵泡沫控制，如何实现减少泡沫的同时保证发酵过程稳定以及获取的初成品不会影响后续精制是亟待解决的问题。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题、实现鼠李糖脂精制品的工业化生产，本专利技术提供一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法。该利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法的具体步骤如下: (1)双相碳源优势菌株的选育:将铜绿假单胞菌iPsGudomormsaeruginosa)CICC10204活化培养，将活化的菌株转接至1#驯化培养基中培养24-60小时，培养温度32~37°C，转速150-200r/min，将培养后的菌液作为移接种子液以3%~5%的接种量接种至已灭菌的2#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37°C，转速15(T200r/min，再将经2#驯化培养基培养的菌液作为种子液以3%~5%的接种量接种至新配制并灭菌的1#驯化培养基中驯化培养48小时，1#驯化培养基和2#驯化培养基在菌株整个驯化过程是每隔48小时进行交替使用(培养条件相同)，并按照上述方法共转接6~10次，驯化培养结束；将驯化后得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，进行编号划线培养，并逐一进行发酵培养，筛选出2支产鼠李糖脂性能好、代谢油脂能力和乙醇耐受能力强、遗传性能稳定的菌株转接至保藏斜面(牛肉膏蛋白胨培养基)，作为双相碳源优势菌株，4°C保存待用； (2)菌种的扩大培养:将步骤(1)中得到的双相碳源优势菌株斜面活化培养24-48小时，培养温度32~37°C，然后接种至种子培养基中培养24-36小时，培养温度32~37°C，转速15(T200r/min，得到一级种子液；按3~5%的接种量将一级种子液转接到新配制的种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37°C，转速15(T200r/min，得到二级种子液；培养过程中的通风量(m3/ m3.min)为 1: (0.6—1.0)； (3)发酵培养:将步骤(2)中得到的二级种子液以3~5%接种量接入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中，培养温度32~37°C，通风量(m3/ m3.min)为1: (0.6~1.0)，搅拌转速15(T220r/min，发酵过程pH值控制在6.3~7.2，培养120~148小时；其中0~30小时植物油用量2%~5%，浓度为20%~50%乙醇用量0.3~0.8% ;30小时后，开始流加浓度为20~50%的乙醇，每隔20-24小时流加一次，每次流加量为0.2~1%，直至发酵培养结束；发酵过程中产生的泡沫的控制方法采用喷淋和瞬时压差协同作用法:将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为f2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1-0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐； (4)分离提纯:将步骤(3)得到的发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖；将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得鼠李糖脂工业化提纯品。所述步骤(1)中的1#驯化培养基的配方为(按质量百分比):植物油3飞％，浓度为20~50%的乙醇0.1-1,葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.3~0.6%,牛肉膏0.1-0.4%, MgSO40.02~0.08%, KH2PO4 0.1-0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η20 0.00001 ~0.00003%，微量元素混合液0.3^0.8%，余量为水，培养基pH值7.0-7.2 ；2#驯化培养基的配方为(按质量百分比):植物油1~3.5%，浓度为20~50%的乙醇1.5~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏 0.1~0.4%, MgSO4 0.02~0.08%, ΚΗ2Ρ04 0.1~0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η200.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2。所述步骤(2)中的种子培养基的配方为(按质量百分比):植物油2飞％，浓度为20%~50%本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法，其特征在于:该方法的具体步骤如下: (1)双相碳源优势菌株的选育:将铜绿假单胞菌iPsGudomormsaeruginosa)CICC10204活化培养，将活化的菌株转接至1#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37°C，转速150~200r/min，将培养后的菌液作为移接种子液以3%~5%的接种量接种至已灭菌的2#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37°C，转速150~200r/min，再将经2#驯化培养基培养的菌液作为种子液以3%~5%的接种量接种至新配制并灭菌的1#驯化培养基中驯化培养48小时，1#驯化培养基和2#驯化培养基在菌株整个驯化过程是每隔48小时进行交替使用(培养条件相同)，并按照上述方法共转接6~10次，驯化培养结束；将驯化后得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，进行编号划线培养，并逐一进行发酵培养，筛选出2支产鼠李糖脂性能好、代谢油脂能力和乙醇耐受能力强、遗传性能稳定的菌株转接至保藏斜面(牛肉膏蛋白胨培养基)，作为双相碳源优势菌株，4°C保存待用； (2)菌种的扩大培养:将步骤(1)中得到的双相碳源优势菌株斜面活化培养24~48小时，培养温度32~37°C，然后接种至种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37°C，转速150~200r/min，得到一级种子液；按3~5%的接种量将一级种子液转接到新配制的种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37°C，转速150~200r/min，得到二级种子液；养过程中的通风量(m3/ m3.min)为 1: (0.6—1.0)； (3)发酵培养:将步骤(2)中得到的二级种子液以3~5%接种量接入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中，培养温度32~37°C，通风量(m3/ m3.min)为1: (0.6~1.0)，搅拌转速150~220r/min，发酵过程pH值控制在6.3~7.2，培养120~148小时；其中0~30小时植物油用量2%~5%，浓度为20%~50%乙醇用量0.3~0.8% ;30小时后，开始流加浓度为20~50%的乙醇，每隔20-24小时流加一次，每次流加量为0.2~1%,直至发酵培养结束；发酵过程中产生的泡沫的控制方法采用喷淋和瞬时压差协同作用法:将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为f2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1~0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐； (4)分离提纯:将步骤(3)得到的发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈韶军，黄玉才，于洋，隋志强，张烨，金艳方，白丽莉，王延兵，
申请(专利权)人：大庆沃太斯化工有限公司，
类型：发明
国别省市：