番鸭细小病毒和鹅细小病毒的hrm鉴别方法、试剂盒和引物组技术

本发明专利技术公开了一种番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM鉴别方法、试剂盒和引物组，所述检测方法包括如下步骤：（1）设计一组可同时扩增番鸭细小病毒和鹅细小病毒的通用PCR引物；（2）从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA；（3）利用步骤（1）的引物组对模板DNA进行PCR扩增；（4）对扩增产物进行HRM分析，鉴别MDPV和GPV。本发明专利技术方法：可快速、有效鉴别MDPV和GPV；检测速度快且高通量：5～10分钟即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间；对PCR产物无损害，检测后还可以进行后续分析，如测序和凝胶电泳等。

【技术实现步骤摘要】
番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM鉴别方法、试剂盒和引物组
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)的HRM鉴别方法、鉴别试剂盒和引物组。
技术介绍
番鸭细小病毒(Muscovyduck parvovirus, MDPV)和鶴细小病毒(gooseparvovirus, GPV)是两种水禽病毒。MDPV和GPV两种病毒粒子的理化特性、形态结构非常相似，因此很难通过显微观察将这两种病毒鉴别区分开来。其基因组同源性达81.9 %，氨基酸同源性达到88.96 %，其中结构蛋白VPl的同源性达87.57 %，从而决定了它们在抗原性上的高度同源，同时也使这两种病毒的抗血清之间存在交叉保护性。所以，在乳胶凝集试验、琼脂扩散试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等常规的血清学检测方法中，只有应用MDPV和GPV单克隆抗体才能将这两种病毒区分开来。这无疑提高了鉴别的成本和操作复杂性。虽然国内的许多学者已经针对MDPV和GPV基因组分别设计特异性的引物，建立了鉴别MDPV和GPV的PCR检测技术，但是该方法通常需要设计2对特异性的引物，而且判定结果需要进行凝胶电泳，所以该方法在进行高通量的检测任务时会显得费时费力。高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting ),简称HRM ,其技术原理主要是基于核酸分子物理性质的不同:不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
技术实现思路
`针对现有技术中所存在的不足，本专利技术通过分析MDPV和GPV基因组，在VP3基因中找出了一段相对保守序列，针对该序列设计了一对既能扩增MDPV又能扩增GPV的通用弓丨物，我们利用该引物对MDPV和GPV DNA进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者熔解曲线的不同来鉴别MDPV 和 GPV。因此，本专利技术的一个目的在于提供一种快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM方法。本专利技术的另一个目的在于提供一组用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的引物。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是: 一种快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM方法，其步骤包括:(1)设计一组可同时扩增番鸭细小病毒和鹅细小病毒的通用PCR引物； (2)从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA ； (3 )利用步骤(1)的引物组对模板DNA进行PCR扩增； (4)对扩增产物进行HRM分析，鉴别MDPV和GPV。作为优选的，所述PCR引物的序列如下所示:MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。所述PCR扩增的反应体系为: ddH20 4.6 μ l 5XQ5 Reaction buffer 2 μ l 2.5 mM dNTP0.8 μ l MGV-Pl0.5μ l MGV-P20.5 μ l 模板DNA I μ l Q5 High-Fidelity DNA Polymerase0.1 μ l LC green 染料0.5 μ lTotal 10 μl。所述PCR扩增的反应程序为:98°C预变性30s ;98°C变性10s，55°C退火20s，72°C延伸20s ;循环35次；72°C终延伸2min。一组用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的引物，其核苷酸序列分别如下所示:MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。一种用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、荧光染料，阳性对照和阴性对照。所述荧光染料为LC green饱和荧光染料。所述阳性对照为含有MDPV的VP3基因序列(SEQ ID NO: 3)的质粒和含有GPV的VP3基因序列(SEQ ID N0:4)的质粒；所述阴性对照为ddH20。本专利技术的有益效果是: (1)本专利技术方法和试剂盒的稳定性和重复性高，可准确、有效鉴别MDPV和GPV，且检测速度快且高通量，5~10分钟即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间，降低鉴别成本； (2)本方法不需要进行PCR产物的分离，真正实现了闭管操作，避免污染； (3)对PCR产物无损害，检测后还可以进行后续分析，如测序和凝胶电泳等。【专利附图】【附图说明】图1是MDPV和GPV质粒样品标准化熔解曲线图；图2是MDPV和GPV质粒样品峰型化熔解曲线图； 图3是MDPV和GPV临床样品PCR的电泳图； 图4是MDPV和GPV临床样品DNA标准化熔解曲线图； 图5是MDPV和GPV临床样品DNA峰型化熔解曲线图； 图6是MDPV和GPV临床样品DNA差异化熔解曲线图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)的HRM快速鉴别试剂盒的建立: 1、引物设计:以MDPV-FM和GPV-B的VP3基因(GenBank登录号分别为U22967和U25749)为靶基因，设计一对引物，序列如下:MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。2、PCR反应液:Taq DNA聚合酶；5XPCR反应缓冲液；2.5 mM dNTP ;荧光饱和染料； 3、阳性对照为MDPV和GPV的阳性质粒，阴性对照为ddH20。其中阳性质粒的制备方法如下: 用TaKaRa公司的试剂盒将MDPV的VP3基因(SEQ ID NO: 3)和GPV的VP3基因(SEQID N0:4)分别连接至pMD-18T载体中，通过氨苄筛选、测序，筛选得到阳性克隆子即为阳性对照。实施例2建立番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV) HRM快速鉴别方法 利用实施例1的试剂盒快速鉴别番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)的方法，包括如下步骤: 1、对实施例1制备的MDPV和GPV的阳性质粒进行DNA浓度测定，使PCR起始模板浓度相对一致。2、PCR扩增反应 (I) PCR 反应体系:5XQ5 Reaction buffer 2μ 1,2.5 mM dNTP 0.8 μ I, MGV-Pl(10 μ Μ) 0.5 μ I, MGV-Pl (10 μ Μ) 0.5 μ I, Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.1μ 1，质粒DNA 0.5 μ 1，LC Green 0.5 μ 1，用超纯水补齐到10 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM方法，其步骤包括: (O设计一组可同时扩增番鸭细小病毒和鹅细小病毒的通用PCR引物； (2)从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA ； (3 )利用步骤(1)的引物组对模板DNA进行PCR扩增； (4)对扩增产物进行HRM分析，鉴别MDPV和GPV。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR引物是以番鸭细小病毒和鹅细小病毒的VP3基因为靶基因设计的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR引物的序列如下所示: MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为: ddH20 4.6 μl 5XQ5 Reaction buffer 2 μl 2.5 mM dNTP0.8 μl MGV-Pl0.5μ l MGV-P20.5 μ l 模板DNA l μ l Q5 High-Fidelity DNA Polymerase0.1 μ l ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭鹏举，董嘉文，张建峰，陈琴苓，嘎利兵嘎，孙敏华，李林林，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：