本发明专利技术公开了一种利用基因工程手段提高纤维堆囊菌埃博霉素B产量的方法。将透明颤菌血红蛋白基因vgb接入表达载体PBEP43中得到重组质粒PBEP43-vgb，然后将重组质粒PBEP43-vgb电转化进入纤维堆囊菌So?ce?M4中，得到纤维堆囊菌So?ce?M4重组菌，实现提高纤维堆囊菌So?ce?M4的埃博霉素B产量。本发明专利技术采用电转化法对纤维堆囊菌So?ce?M4的基因进行改造，从而大大提高埃博霉素B的产量，具有广阔的应用前景，并且这方面的研究迄今未见报道。
【技术实现步骤摘要】
一种利用基因工程手段提高纤维堆囊菌埃博霉素B产量的方法
:本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种利用基因工程手段提高纤维堆囊菌埃博霉素B产量的方法。
技术介绍
:埃博霉素是一类由纤维堆囊菌产生的具有较强抗肿瘤活性的大环内酯类化合物，据报道，埃博霉素B的抗肿瘤活性是紫杉醇的10-100倍，而且埃博霉素对P-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系显示很强的抗肿瘤活性，因此肿瘤细胞不易对其产生耐药性。而人们对纤维堆囊菌的研究主要集中在通过优化发酵条件，紫外诱变等手段来提高埃博霉素的产量。目前通过物理和化学方法可以使埃博霉素A的产量达到18-22mg/L，埃博霉素B的产量达到8-9mg/L。距离规模化生产仍有一定距离。纤维堆囊菌SMP44和So ce90的埃博霉素基因簇已经被鉴定，但由于纤维堆囊菌的遗传操作较为困难，人们将埃博霉素基因簇克隆至橙黄色粘球菌、大肠杆菌和天蓝色链霉菌中进行表达，但由于埃博霉素的细胞毒性导致埃博霉素产异源表达的产量比较低。埃博霉素B的最高产量仅为2.5mg/L。因此，通过遗传操作手段对纤维堆囊菌进行改造以制备埃博霉素B高产工程菌株可以促进高效抗癌新药的开发。已经有很多研究者尝试将透明颤菌血红蛋白基因vgb导入到不同宿主中，以提高生物体生长速率及目的代谢产物产量，但由于纤维堆囊菌遗传操作手段的匮乏，vgb基因还未应用于纤维堆囊菌的基因工程改造。目前，关于利用基因工程手段改造纤维堆囊菌以提高埃博霉素产量的研究报道还比较少，龚国利等(龚国利，陈松，李慧，曾桥，李楠，宋娟娜。基因重组技术选育埃博霉素B高产菌株。中国抗生素杂志，2013，(2):106-111)利用基因组重组技术对4株产埃博霉素纤维堆囊菌进行了原生质体融合，通过五轮基因组重组技术选育得到埃博霉素B高产菌株，虽然该方法在一定程度上提高埃博霉素产量，但该方法耗时较长，需要较多埃博霉素产生菌株，操作步骤相对复杂，而且结果具有随机性，不具有通用性。因此，建立稳定、方便且快捷的纤维堆囊菌遗传育种方法来提高埃博霉素产量能节约埃博霉素生产成本，具有更好的工业应用前景，从而促进埃博霉素在抗肿瘤治疗方面的进一步广泛应用。
技术实现思路
:本专利技术的第一个目的是提供一种利用基因工程手段提高纤维堆囊菌埃博霉素B产量的方法。本专利技术的利用基因工程手段提高纤维堆囊菌埃博霉素B产量的方法，其特征在于，包括以下步骤:将透明颤菌血红蛋白基因vgb接入表达载体PBEP43中得到重组质粒PBEP43-vgb，然后将重组质粒PBEP43-vgb电转化进入纤维堆囊菌So ce M4中，得到纤维堆囊菌So ce M4重组菌，实现提高纤维堆囊菌So ce M4的埃博霉素B产量。本专利技术的第二个目的是提供一种高产埃博霉素B纤维堆囊菌So ce M4，其通过以下方法制备，将透明颤菌血红蛋白基因vgb接入表达载体PBEP43中得到重组质粒PBEP43-vgb，然后将重组质粒PBEP43-vgb电转化进入纤维堆囊菌So ce M4中，得到纤维堆囊菌So ce M4重组菌，即为高产埃博霉素B的纤维堆囊菌So ce M4。所述的电转化，其电转化条件为:1500V，5.0ms。本专利技术的纤维堆囊菌So ce M4分离自广东的土壤样品，其公开于文献:张庆波，王磊，章卫民。广东6株纤维堆囊菌的分离与鉴定。吉林农业大学学报，2010，32 (4) =387-393,该菌种本专利技术人也持有，保证自本专利技术的申请日起20年内向公众提供。本专利技术采用电转化法对纤维堆囊菌So ce M4的基因进行改造，从而大大提高埃博霉素B的产量，具有广阔的应用前景，并且这方面的研究迄今未见报道。【专利附图】【附图说明】:图1为纤维堆囊菌So ce M4重组菌的阳性克隆平板。图2为纤维堆囊菌So ce M4的RNA及RT-PCR图:2A为So ce M4重组菌及原始菌的 RNA 电泳图，M:DL2000DNA marker，Ianel:原始 So ce M4RNA，lane2:重组 So ce M4RNA ；2B 为 RT-PCR 鉴定图，M:DL2000DNA marker, lanel:重组 So ce M4RT-PCR，lane2:原始 Soce M4RT-PCR, lane3:空白对照，lane4:以质粒 PBEP43_vgb 为模板 PCR。图3为以重组So ce M4RNA为模板进行RT-PCR扩增所得条带进行测序结果。图4为So ce M4原始菌 及重组菌的HPLC峰图，埃博霉素B标准品作为对照。图5为So ce M4原始菌及重组菌的LC-MS鉴定图，以埃博霉素B标准品作为对照。【具体实施方式】:以下将参照附图，结合具体实施例对本专利技术进行进一步解释。但实施例本身对专利技术不做任何形式的限定。实施例1:纤维堆囊菌So ce M4的电转化及鉴定，包含如下步骤:(I)配制液体培养基(8g/L马铃薯淀粉，2g/L葡萄糖，2g/L大豆蛋白酶解物，2g/L酵母提取物，8mg/L EDTA 铁钠，lg/L MgSO4.7H20, lg/L CaCl2,0.5g/L Tris，溶剂为水，用盐酸调pH至7.4。115°C，25min灭菌)，以2.5%的接种量接种纤维堆囊菌So ce M4至30ml液体培养基，300C，180rpm培养至0D595nm为0.8左右，将菌液冰浴lOmin，6000rpm，4°C离心6min，收集细胞，用冰预冷的无菌水洗涤菌体2次，用400 μ I无菌水悬浮细胞，以100 μ I每管进行分装。(2)大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒ΡΒΕΡ43的构建方法公开于文献:罗文华，郭勇，韩双艳。豆豉纤溶酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高水平表达。应用与环境生物学报，2007，13 (4):565-569。使用SalI和BamHI分别对ΡΒΕΡ43和vgb基因进行双酶切，连接，构建重组质粒PBEP43-vgb。取重组质粒PBEP43-vgb (vgb基因的GenBankaccession:AF274976.1)) 3 μ L与So ce M4感受:态混合,转移至2mm电转杯中冰浴3min，用Eppendorf电转仪进行电转，设定条件为:1500V，5ms。电转完毕立即加入30°C预热的液体培养基，于30°C, 150rpm条件下修复6h。取500 μ L菌液涂布至含50 μ g/mL卡那霉素和100 μ g/mL氨苄青霉素的固体平板。挑取含抗性平板上的菌落(如图1所示)，于含有相应抗性的液体培养基中扩大培养，待菌液生长至对数生长期时，进行菌液PCR。所用上游、下游引物如SEQ ID N0:l-2所/Jn ο其反应体系如下:本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用基因工程手段提高纤维堆囊菌埃博霉素B产量的方法，其特征在于，包括以下步骤:将透明颤菌血红蛋白基因vgb接入表达载体PBEP43中得到重组质粒PBEP43-vgb，然后将重组质粒PBEP43-vgb电转化进入纤维堆囊菌So ce M4中，得到纤维堆囊菌So ceM4重组菌，实现提高纤维堆囊菌So ce M4的埃博霉素B产量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的电转化，其电转化条件为:1500V，5.0ms。3.一种高产埃博...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶伟，章卫民，王磊，陈玉婵，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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