本发明专利技术公开一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，所述AMC代谢恢复株为StreptococcusmutansKO-SUA159：：△luxS,pIB-sahH，保藏编号为CCTCCM2013699。本发明专利技术通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahH，将LuxS介导的代谢与密度感应分离，有效克服了由LuxS缺失的双重缺陷效应引起的LuxS机制研究障碍，为变异链球菌LuxS调控机制的探讨提供了有效的分子生物学工具和实验对照。
【技术实现步骤摘要】
基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株
本专利技术涉及微生物密度感应机制研究领域，更具体地讲，涉及基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株及其构建。
技术介绍
生物膜是自然界中大多数微生物的存在形式，其形成可大大增强微生物的生存能力及抵抗来自环境、宿主和抗菌药物的能力，因此生物膜形成成为许多慢性顽固性感染疾病的主要发病因素。密度感应在生物膜的形成、发展和成熟中发挥重要作用。密度感应(quorum sensing, QS)是细菌的一种群体交流机制，即细菌通过合成、分泌并感知环境中的信号分子，以调节自身某些基因的表达。在已知的多种信号分子中，自诱导分子-2(autoinducer-2, A1-2)因其产生基因IuxS保守存在于不同细菌中而其被认为参与了菌种间的信号传递。通过敲除IuxS基因，许多研究表明LuxS/介导的密度感应缺陷会导致细菌许多生理表现损伤，包括生物膜形成障碍。但实质上，A1-2是细菌甲基循环(AMC)过程中的一种副产物(甲基循环过程见附图1)，由其产生过程可知，LuxS同时催化A1-2和HCY的生成，因此，LuxS缺失不仅会导致A1-2介导的密度感应缺陷，同时会导致AMC通路障碍。因此，由LuxS缺失导致的功能障碍也有可能是由AMC障碍引起的。显然，LuxS缺失的密度感应和代谢双重缺陷效应，使得LuxS调控机制的研究变得困难，由此，在LuxS调控机制探讨中，密度感应和AMC代谢通路的分离变得至关重要。变异链球菌是已知的主要致龋菌之一，而生物膜即牙菌斑形成和耐酸性是其两大重要致龋因素。研究表明LuxS缺失会导致变异链球菌的许多生理障碍，包括许多龋病发生相关的致病特性变化。而在障碍发生机制的研究中，同样存在密度感应和代谢调控的争议。过去普遍认为LuxS/A1-2介导的密度感应机制在这些生理变化中发挥主要作用。但近年来，许多研究通过加入外源A1-2的方法，发现LuxS缺失导致的许多基因转录变化或生理特性改变并未得到恢复。由此LuxS/A1-2介导的密度感应在LuxS调控功能中的影响逐渐被削弱。显然，作为LuxS调控功能的另一贡献成员，代谢通路在变异链球菌LuxS相关生理特性中的调控作用值得重视。在一些缺乏IuxS基因的细菌如绿脓杆菌中，AMC的完成主要依靠SahH完成。SahH直接催化SAH生成HCY而不会产生副产物DPD，因此为密度感应和代谢的分离提供有利工具。SahH恢复代谢的能力已被研究证明(Sylvio Redanz, Kerstin Standar, AndreasPodbielski， and Bernd Kreikemeyer.Heterologous Expression of HeterologousExpression of sahH Reveals That Biofilm Formation Is Autoinducer-2-1ndependentin Streptococcus sanguinis but Is Associated with an Intact ActivatedMethionine Cycle .J Biol Chem.2012 October 19; 287(43): 36111 - 36122.)，以此为基础，我们以变异链球菌LuxS缺陷株为模型，利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达载体引入外源SahH，构建了变异链球菌密度感应缺陷背景下的代谢恢复株，实现了代谢与密度感应的分离。为今后LuxS对变链菌功能调控机制的深入研究提供研究工具。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，从而实现LuxS介导的代谢途径与密度感应途径的分离。本专利技术的第二个目的在于提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法。为实现以上第一个目的，本专利技术公开以下技术方案:一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，其特征在于，所述AMC代谢恢复株为Streptococcus mutans KO-SUA159::Δ IuxS, pIB-sahH，保藏编号为 CCTCC M 2013699。为实现以上第二个目的，一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达质粒PIB169，通过酶切、连接，将体外PCR扩增出的sahH和IuxS基因片段连接到载体上，构建出大肠杆菌-变异链球菌SahH蛋白的穿梭表达质粒及作为阳性表达对照的LuxS蛋白表达质粒； (2)质粒经序列鉴定后首先转化入大肠杆菌,通过westernblot检测SahH和LuxS蛋白表达，验证载体和目的基因的表达能力； (3)利用CSP诱导变异链球菌感受态形成，将质粒转化入变异链球菌，通过质粒抽提双酶切验证质粒转化成功； (4)通过RNA抽提、反转录及PCR验证目的基因的成功转录； (5)利用A1-2报告菌株哈维氏弧菌BB170对A1-2的分泌进行检测，以阳性表达对照的A1-2分泌阳性为证据，验证SahH蛋白在变异链球菌中的成功表达。本专利技术基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株分类命名为=Streptococcusmutans KO-S UA159::Δ IuxS, pIB-sahH (下称 K0-S)，保藏编号为:CCTCC M 2013699，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心(保藏地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072)，保藏日期为:2013年12月24日。本专利技术的优点在于:本专利技术通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahHdfLuxS介导的代谢与密度感应分离，有效克服了由LuxS缺失的双重缺陷效应引起的LuxS机制研究障碍，为变异链球菌LuxS调控机制的探讨提供了有效的分子生物学工具和实验对照。【专利附图】【附图说明】图1为甲基循环(AMC)过程及A1-2的产生。硫腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体为细菌DNA、RNA及蛋白合成等提供甲基，生成有毒性的硫腺苷同型半胱氨酸(SAH)，在多数细菌中，毒性的SAH通过Pfs和LuxS两步催化途径生成同型半胱氨酸(HCY)，同时产生信号分子A1-2的前体DPD，而在部分无IuxS基因的细菌中，毒性SAH向HCY的转化则依赖SahH的一步催化而不产生A1-2。继而，HCY经甲硫氨酸(MET)最终生成SAM，完成甲基循环。图2为质粒pIB169图谱及酶切鉴定图。(A)为pIB169示意图，质粒pIB169大小约为4.6kb，带有外源强启动子Pveg、氯霉素抗性基因(Cmr)用于外源基因插入的多克隆位点(MCS)以及可与目的代表融合表达的His标签。其中，位点EcoRI和BamHI为目的基因插入位点。(B)为酶切鉴定图，目的条带大小约为4.6kb。(C)为质粒的多克隆位点序列。图3为质粒pIB-luxS和pIB-sahH构建示意图。目的基因IuxS约为500bp，sahH约为1400bpo IuxS, sahH和质粒pIB169均用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，消化后的IuxS与消化的pIB169连接,生成质粒pIB-luxS (大小约5.1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，其特征在于，所述AMC代谢恢复株为 Streptococcus mutans KO-S UA159::Δ IuxS, pIB-sahH,保藏编号为 CCTCC M2013699。2.权利要求1所述一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达质粒PIB169，通过酶切、连接，将体外PCR扩增出的sahH和IuxS基因片段连接到载体上，构建出大肠杆菌-变异链球菌SahH蛋白的穿...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄正蔚，王玉霞，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：
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