本发明专利技术涉及“芥菜基因组定点突变系统及其应用”，属于生物【技术领域】。基因组定点突变系统，其特征在于：所述系统由特异识别目的基因两个靶序列的两个转录激活效应因子核酸酶（TALEN）所组成；所述两个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’端的第二靶序列；所述两个转录激活效应因子核酸酶由转录激活子效应因子核酸酶TALEN‐L和TALEN‐R组成，所述TALEN‐L和TALEN‐R分别特异性识别第一靶序列和第二靶序列。本发明专利技术还公开了该删除系统的应用，能提供丰富的育种材料，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
芥菜基因组定点突变系统及其应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及基于TALEN技术的基因组定点突变系统及其应用。
技术介绍
芥菜是十字花科(Cruciferae)芸苔属一年生或二年生草本。是中国著名的特产蔬菜，欧美各国极少栽培，起源于亚洲。近十多年以来的，反向遗传学技术已广泛应用于植物种质资源的研究和遗传育种，人们通过各种途径在作物中制备和筛选突变体，并陆续建立了多种方法，比如EMS化学诱变、TILLING，但这些方法都有各自的局限性。本专利技术构建了应用于茄子的TALEN双元表达载体，通过转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)对芥菜FRIGIDA基因进行了体外定位修饰，为芥菜种质资源的创新和丰富提供了重要的理论意义。尽管转基因和RNAi等技术目前已广泛应用于芥菜育种研究，但是能直接对芥菜基因进行编辑和改造的技术尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于TALEN技术的基因定点突变系统和该系统的应用，利用该系统能够对靶标基因位点进行定点切割，造成缺失/插入突变，为育种材料提供丰富的遗传资源。基因组定点突变系统，其特征在于:所述系统由特异识别目的基因两个靶序列的两个转录激活效应因子核酸酶(TALEN)所组成；所述两个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’端的第二靶序列；所述两个转录激活效应因子核酸酶由转录激活子效应因子核酸酶TALEN - L和TALEN - R组成，所述TALEN - L和TALEN - R分别特异性识别第一靶序列和第二靶序列。所述靶序列结构为T (N) nA的核苷酸序列，其中N为A，T，G和C中的任一碱基，η为13 - 22之间的任一整数。所述目的基因为芥菜基因FRIGIDA。所述第一靶序列由SEQ ID NOl所示核苷酸，所述TALEN - L由SEQ ID N02所示核苷酸编码SEQ ID N03所示的蛋白质组成；所述第二靶序列由SEQ ID N04所示核苷酸，所述TALEN - R由SEQ ID N05所示核苷酸编码SEQ ID N06所示的蛋白质组成。上述基因 组定点突变系统在靶细胞中对目的基因的定点突变的应用。所述靶细胞为芥菜细胞。所述目的基因为芥菜基因FRIGIDA。 本专利技术通过利用TALEN技术，通过TALEN具有特异性识别双链核酸靶序列的特点，在目的基因内设计成对的含有识别靶序列的TALEN，并在TALEN中设计核定位信号，是目标蛋白定位在细胞核中。成对的含有识别靶序列的TALEN通过C端核酸酶FokI对识别靶序列间的序列进行非特异性切割，随后在胞内断裂的核苷酸通过NHEJ方式进行修复，这一修复的结果便是在切割位点造成了插入/缺失突变，从而获得该目的基因的突变体，为育种工作提供丰富的遗传资源。【专利附图】【附图说明】图1PCR 结果，图2突变前后序列对比。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。下面所涉及到的原始质粒和原始菌株及试剂，均为市售。实施例1、芥菜FRIGIDA基因片段的获得通过引物对(上游5’ - TGCCTACAAACACGGAAAT - 3’，下游5’ - AAGGGCCATACAAATGCTAT - 3’)扩增得到芥菜FRIGIDA - b基因包含第一外显子和第一内含子的片段。本实施例以第一外显子为靶标为点。实施例2、第一外显子核酸酶TALEN - L和TALEN - R的设计根据芥菜FRIGIDA基因第一外显子序列特征，选择第一外显子3’端序列作为转录激活子效应因子核酸酶TALEN - L和TALEN - R的靶序列。根据TALEN识别原理，设计的TALEN 识别靶序列为 5’ - TGAGATTGCTGCTGCTctaaaacggtcacctttccttgtCCCTATGATGTCAGGTA - 3’，大写部分为转录激活子效应因子核酸酶TALEN - L和TALEN - R的识别模块，小写部分为间隔序列，其中5，端为TALEN - L识别模块(SEQ ID N01)，3，端为TALEN - R识别模块(SEQ ID N04)。最终在TALEN蛋白上游设置核定位信号，下游设置核酸酶FokI，得到具有识别模块和融合核酸酶FokI的TALEN - L和TALEN - R0根据TALEN - L和TALEN - R的氨基酸序列设计编码核苷酸序列，其中TALEN - L编码核苷酸序列为SEQ ID N02, TALEN - R编码核苷酸序列为SEQ ID N05。通过酶切将TALEN-L和TALEN-R片段连接pColdl DNA，对转化子进行PCR和双酶切鉴定，对鉴定正确的转化子送测序。将测序正确的重组质粒命名为PCold1- 12#，并转化E.coli Rosetta菌株中进行诱导表达，将含有含有正确转化子的的E.coli Rosseta单菌落接种于含氨苄青霉素的5ml LB培养基中，37°C 200rpm过夜培养，次日将培养物按1:100接种至含氨苄青霉素的LB培养基中于37°C 200rpm振荡培养至0D600达到0.6，然后将培养物置于15°C静置30分钟，然后在培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM,于15°C 180rpm诱导24小时。诱导结束后离心收集菌体，使用5ml MCAC-20缓冲液(含20mM咪唑，ImM PMSF,10%Triton X-100,10ug/ml DNase I)重悬菌体，超声破碎后25000g离心30分钟，上清取5ul用于SDS-PAGE分析，剩余上清通过0.22um过滤后过Ni2+_NTA柱(Qiagen)，用MCAC-300(300mM咪唑)洗脱，收集柱穿透液，取样IOul用于SDS-PAGE和双向电泳检测。同时以含PCold I DNA的E.coli Rosseta作为对照。经低温诱导获得带有组氨酸标签的TALEN-L和TALEN-R原核表达产物，随后使用该产物与人工合成的靶序列在体外进行37°C酶切，判断 TALEN 活性，该 酶切体系为 IOOmmoI/L Tris - HCl ρΗ7.5，IOOmmoI/L MgC12, IOmmoI/LDTT,500mmol/L NaCl,5% 甘油和 1%BSA。实施例3，TALEN - L和TALEN - R功能验证构建TALEN -L和TALEN -R的双元表达载体转化农杆菌GV3101，检测阳性重组体侵染芥菜下胚轴。诱导再生植株提取基因组，使用T7内切酶检测突变，检测体系为T7Elbuffer2 μ I, DNA2 μ I, Τ7Ε11 μ I, ddH205 μ I。随后使用引物对(上游5’ -TGCCTACAAACACGGAAAT -3’，下游5’ - AAGGGCCATACAAATGCTAT - 3’)扩增突变体FRIGIDA基因片段，PCR反应体系为:为 ddH2032.8 μ 1，10XPCR buffer5 μ I, 2mM dNTP5 μ I, 25mM MgS043 μ I,上下游引物各 1.5 μ 1，KOD DNAPolymerase (Toyobo) I μ I, template DNAl μ I。随后将该片段克隆至PMD19 - T载体测序，分析突变体(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基因组定点突变系统，其特征在于:所述系统由特异识别目的基因两个靶序列的两个转录激活效应因子核酸酶(TALEN)所组成；所述两个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’端的第二靶序列；所述两个转录激活效应因子核酸酶由转录激活子效应因子核酸酶TALEN - L和TALEN - R组成，所述TALEN - L和TALEN - R分别特异性识别第一靶序列和第二靶序列，最终完成对两靶序列中间序列的非特异性剪切。2.根据权利要求1所述的基因组定点突变系统，其特征在于:所述靶序列结构为T(N)nA的核苷酸序列，其中N为A，T，G和C中的任一碱基，η为13 - 22之间的任一整数。3.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋明，孙梓健，李念祖，汤青林，王志敏，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。