一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法，包括如下步骤：在无菌条件下采集原料样品并获得葡萄表皮，选用YEPD液体培养基，加入若干颗葡萄表皮，在28℃恒温摇床震荡培养48小时，得到葡萄表皮酵母菌富集液；制备分离鉴别培养基WL，直接梯度稀释葡萄表皮酵母菌富集液，分别吸取100μL稀释液，涂布在WL培养基上，在37℃倒置培养5天后观察结果，直接根据菌落形态对酵母菌进行计数和形态学记录。本发明专利技术充分考虑人为或者使用物品、运输过程对原料样品产生的不利影响，并直接在WL培养基上进行分离和鉴别，一步到位，节约时间的同时也有效减少了被漏掉菌群的弊端，增加了酵母菌类型。

Method for rapidly separating yeast from grape skin

The invention discloses a method for rapid isolation of yeasts from grape skin epidermis, which comprises the following steps: collecting raw samples and get the grape skin under sterile conditions, the culture medium of YEPD liquid, adding some grape skin, shake culture for 48 hours in a constant temperature of 28 DEG C table, get the grape skin enriched yeast liquid preparation and separation; differential medium WL, direct gradient dilution grape skin enriched yeast liquid, respectively from 100 L dilution, coating on the WL medium, the culture results were observed after 5 days at 37 DEG C inversion directly according to colony morphology were counted and recorded on the morphology of yeast. The invention fully consider the detrimental effects of man-made or the use of goods and transportation of raw material samples were produced, and directly on the WL medium were isolated and identified, in one step, saving time and reduce the missed defects of flora, increased yeast type.

【技术实现步骤摘要】
一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法
本专利技术属于酵母菌分离
，具体涉及一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法。
技术介绍
酵母菌是一种单细胞真核微生物，也是人类实践活动中应用较早的一类微生物。酵母菌在自然界中的分布很广，主要是生长在偏酸性的高糖环境中，在水果，蔬菜的表面和果园的土壤中较为常见，葡萄成熟时，葡萄皮上会粘附多种类型的天然酿酒酵母，酿酒师有时就用它来发酵。现在随着技术的不断成熟，酿酒师越来越多地利用从天然酵母中精挑细选出来的酵母菌株进行发酵，因为不同的酿酒酵母品种有其独特的发酵特点，所产生的味道也各不相同。但是，传统的分离方法只能分离出较少类型的酵母菌，这对于以葡萄皮为原料充分分离得到多种类型酵母菌来说，是远远不够的。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法，能够分离并鉴别得到多种酵母菌类型，大大扩展了产品种类。具体的，本专利技术提供的从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法，具体包括如下步骤：S1：葡萄的采摘与运输准备无菌口罩、无菌手套、无菌塑料盒子、无菌剪刀和低温冷冻盒，操作人员佩戴无菌口罩和无菌手套，选择新鲜健康的枝条，用无菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用无菌手套轻拿轻放入无菌塑料盒子内，快速转入低温冷冻盒，运输回实验室；S2：葡萄皮的获得准备无菌手套、无菌手术刀、无菌镊子和无菌离心管，在超净工作台内，戴上无菌手套，逐个摘下葡萄粒，用无菌手术刀在葡萄果实中部拉开一道1cm长的口子，用无菌镊子夹住开口的两端均匀用力撕下葡萄表皮，装入无菌离心管中，备用；S3：葡萄表皮酵母菌的富集选用YEPD液体培养基，加入若干颗葡萄表皮，在28℃恒温摇床中，转速为180rpm，震荡培养48小时，得到葡萄表皮酵母菌富集液；S4：快速分离鉴别酵母菌制备分离鉴别培养基WL，直接梯度稀释葡萄表皮酵母菌富集液，选择10-3、10-4、10-5三个稀释度，分别吸取100μL稀释液，涂布在WL培养基上，在37℃倒置培养5天后观察结果，直接根据菌落形态对酵母菌进行计数和形态学记录。优选地，S3中，每20mLYEPD液体培养基中加入8～10颗葡萄表皮。更优选地，所述葡萄表皮是在众多葡萄表皮中随机选择得到的。优选地，每升YEPD液体培养基包括以下组分：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，余量为蒸馏水，且YEPD液体培养基的的pH为6.1。与现有技术相比，本专利技术的方法具有以下有益效果：(1)充分考虑人为或者使用物品、运输过程对原料样品产生的不利影响；(2)考虑到原料样品的代表性和完整性，本申请使用的是从所有样品中随机挑选一定数量的颗葡萄表皮，较好代表了所有采集样品的特点；(3)由于传统的分离方法是先经过YEDP培养基分离，然后再随机挑选菌落做WL鉴别，这种方法因为挑选的随机性，导致部分浓度低的菌群容易被漏掉，影响了结果的全面性，而本专利技术提供的方法，直接在WL培养基上进行分离和鉴别，一步到位，节约时间的同时也有效减少了被漏掉菌群的弊端。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。实施例1本实施例一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法，具体包括如下步骤：S1：葡萄的采摘与运输，准备无菌口罩、无菌手套、无菌塑料盒子、无菌剪刀和低温冷冻盒，操作人员佩戴无菌口罩和无菌手套，选择新鲜健康的枝条，用无菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用无菌手套轻拿轻放入无菌塑料盒子内，快速转入低温冷冻盒，运输回实验室；这么做可以有效地避免外援引入的污染，减少由此带来的误差。S2：葡萄皮的获得，准备无菌手套、无菌手术刀、无菌镊子和无菌离心管，在超净工作台内，戴上无菌手套，逐个摘下葡萄粒，用无菌手术刀在葡萄果实中部拉开一道1cm长的口子，用无菌镊子夹住开口的两端均匀用力撕下葡萄表皮，备用；S3：葡萄表皮酵母菌的富集，选用YEPD液体培养基，每升YEPD液体培养基包括以下组分：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，余量为蒸馏水，且YEPD液体培养基的的pH为6.1。量取20mL的YEPD液体培养基，向其中加入从S2中随机选取的10颗葡萄表皮，在28℃恒温摇床中，转速为180rpm，震荡培养48小时，离心分离，得到葡萄表皮酵母菌富集液；S4：快速分离鉴别酵母菌，制备分离鉴别培养基WL(每升WL液体培养基含有如下成分：酵母浸粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，磷酸二氢钾0.55g，氯化钾0.425g，氯化钙0.125g，硫酸镁0.125g，氯化铁0.0025g，硫酸锰0.0025g，溴甲酚绿0.022g)，直接梯度稀释葡萄表皮酵母菌富集液，选择10-3、10-4、10-5三个稀释度，分别吸取100μL稀释液，涂布在WL培养基上，在37℃下倒置培养5天后观察结果，直接根据菌落形态对酵母菌进行计数和形态学记录。对比例1本对比例从葡萄皮表皮分离酵母菌的传统分离方法，具体方法为：采用从葡萄粉碎汁液取样后梯度稀释或葡萄完整果实无菌水震荡培养48小时，洗脱液梯度稀释涂布YEPD平板，然后随机挑选单菌落再在WL培养基平板进行鉴别。实施例1提供的从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法与传统分离方法相比，综合考虑了人为或者使用物品、运输过程对样品产生的影响，在采样过程中操作人员佩戴无菌口罩和无菌手套，选择新鲜健康的枝条，用无菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用无菌手套轻拿轻放入无菌塑料盒子内，快速转入低温冷冻盒，运输回实验室，避免了样品污染和人为引入其他杂菌。同时在分离过程中，考虑到样品的代表性和完整性，以新鲜的葡萄表皮为原料，在众多原料中随机挑选一定数量的葡萄表皮，较好代表了所有采集样品的特点。并通过直接在WL培养基上进行分离和鉴别，一步到位，节约时间的同时也有效减少了被漏掉菌群的弊端。经检测，实施例1和对比例1分离获得的酵母菌的类型具体如下表1所示：表1实施例1和对比例1分离获得的酵母菌的类型数量鉴别得到酵母菌类型对比例12实施例15由表1可以看出，采用实施例1提供的方法，能够快速分离获得酵母菌，且酵母菌类型的数量较传统方法显著增加。其中，对比例1中得到了两种酵母分别为路德酵母和毕赤酵母，而实施例1中除了以上两种酵母，还得到了红酵母、酿酒酵母和伊萨酵母。以上所述实施例仅是为充分说明本专利技术而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本
的技术人员在本专利技术基础上所作的等同替代或变换，均在本专利技术的保护范围之内，本专利技术的保护范围以权利要求书为准。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1：葡萄的采摘与运输准备无菌口罩、无菌手套、无菌塑料盒子、无菌剪刀和低温冷冻盒，操作人员佩戴无菌口罩和无菌手套，选择新鲜健康的枝条，用无菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用无菌手套轻拿轻放入无菌塑料盒子内，快速转入低温冷冻盒，运输回实验室；S2：葡萄皮的获得准备无菌手套、无菌手术刀、无菌镊子和无菌离心管，在超净工作台内，戴上无菌手套，逐个摘下葡萄粒，用无菌手术刀在葡萄果实中部拉开一道1cm长的口子，用无菌镊子夹住开口的两端均匀用力撕下葡萄表皮，装入无菌离心管中，备用；S3：葡萄表皮酵母菌的富集选用YEPD液体培养基，加入若干颗葡萄表皮，在28℃恒温摇床中，转速为180rpm，震荡培养48小时，得到葡萄表皮酵母菌富集液；S4：快速分离鉴别酵母菌制备分离鉴别培养基WL，直接梯度稀释葡萄表皮酵母菌富集液，选择10

【技术特征摘要】
1.一种从葡萄皮表皮快速分离酵母菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1：葡萄的采摘与运输准备无菌口罩、无菌手套、无菌塑料盒子、无菌剪刀和低温冷冻盒，操作人员佩戴无菌口罩和无菌手套，选择新鲜健康的枝条，用无菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用无菌手套轻拿轻放入无菌塑料盒子内，快速转入低温冷冻盒，运输回实验室；S2：葡萄皮的获得准备无菌手套、无菌手术刀、无菌镊子和无菌离心管，在超净工作台内，戴上无菌手套，逐个摘下葡萄粒，用无菌手术刀在葡萄果实中部拉开一道1cm长的口子，用无菌镊子夹住开口的两端均匀用力撕下葡萄表皮，装入无菌离心管中，备用；S3：葡萄表皮酵母菌的富集选用YEPD液体培养基，加入若干颗葡萄表皮，在28℃恒温摇床中，转速为180rpm，震荡培养48小时，得到葡萄表皮酵母菌富集液；S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊杰，白艳红，张文叶，何培新，杨旭，郭晨，尚益民，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南,41