一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法。该方法是通过以下步骤实现的：首先根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物FAV‑FQ‑F、FAV‑FQ‑R和探针P；然后提取FAV病毒DNA，采用超纯水溶解；最后采用设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。本发明专利技术提供的方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV，极大地缩短检测时间，可区分同期流行其他的主要血清型；同时避免了普通PCR的假阴/阳性情况，具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于FAV样品的实验室检测。

A double labeled probe real-time fluorescence PCR method for rapid identification of serum type 4 avian adenovirus

The invention belongs to the technical field of biology, in particular to a double labeled probe real-time fluorescence PCR method for rapidly identifying and detecting serum type 4 avian adenovirus. This method is realized by the following steps: firstly, according to the avian adenovirus genome sequence, a pair of primers were designed for FAV FQ F, FAV FQ R and P probe; then extract FAV virus DNA, using ultra pure water dissolved; finally using the primers and probes for testing real-time PCR. The present invention provides a method for the rapid and sensitive and accurate detection of serotype 4 FAV, greatly shorten the detection time, can distinguish the main serotypes of other popular period; at the same time to avoid the ordinary PCR false negative / positive situation, has the advantages of rapid, accurate, sensitive and reproducible, and can be used for FAV detection of laboratory samples.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法
本专利技术属于生物
，涉及一种禽腺病毒的检测方法，具体涉及一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法。
技术介绍
禽腺病毒（Fowladenovirus，FAV）根据抗原性差异可以分为3个群，其中Ⅰ群是传统的禽腺病毒，包括从鸡分离到的12个血清型（FAV1-12）、火鸡2个血清型、鹅3个血清型和鸭2个血清型。禽腺病毒能引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变。自2015年6月开始，山东省部分地区的肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病。该病的传染速度很快，感染的宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种。经鉴定，确定病原为Ⅰ群禽腺病毒。血清分型表明山东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，造成鸡群的死亡率较高，发病急、传播快。荧光探针定量PCR（Real-timePCR）技术融汇PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化。根据PCR反应的酶动力学特点，获得DNA模板的准确定量结果。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行，无需PCR后处理和冗长的电泳、紫外或染色检测，解决了常规PCR实验不能准确定量、操作繁复、污染环境等问题。Real-timePCR可以准确定量出0～10个拷贝的病原体，特异性强，定量范围极宽，具有重要的临床诊断价值。中国专利申请CN105907893A提供了一种荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用，该方法采用的TaqMan-MGB探针价格比较昂贵，而且对AT含量高的序列设计有帮助，条件要求苛刻。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法，该方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV，极大地缩短检测时间。本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法，包括以下步骤：（1）根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物FAV-FQ-F、FAV-FQ-R和探针P；（2）提取待检FAV病毒DNA，采用超纯水溶解；（2）采用设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。进一步的，所述引物的序列为：FAV-FQ-F，如SEQIDNO1所示：5'-CTAGGGTTCTGAACTTTG-3'，FAV-FQ-R，如SEQIDNO2所示：5'-CGGTAAACATTTCAAGGA-3'；所述探针的序列为：探针P，如SEQIDNO3所示：5'-(FAM）TGACGCCAGTTTCGCTTTCG(Eclipse)-3'。进一步的，所述实时荧光PCR反应体系为：PremixExTaq™(ProbeqPCR)12.5μL、引物FAV-FQ-F(10μM)0.5μL、引物FAV-FQ-R(10μM)0.5μL、Probe(5μM)1μL、DNA模板2μL、ddH2O8.5μL。进一步的，所述实时荧光PCR的反应程序为：95℃30s，随后95℃5s、55℃10s、72℃20s进行40次循环。本专利技术提取待检FAV病毒DNA采用的方法为：将待检的病毒接种6日龄的SPF鸡胚的卵黄囊，收集接种后3~7d内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，冻融三次，混合后作为病毒液；上述病毒液，12000rpm离心2min，取0.2mL上清用DNA提取试剂盒提取DNA，最后溶于30μL超纯水中，OD值测定FAV病毒DNA的浓度为6.25×10拷贝/μL，-20℃保存备用。本专利技术的有益效果为：本专利技术根据血清4型FAV的基因组序列，在保守区域设计了特异性扩增引物和探针，即在荧光PCR扩增过程加入一对引物的同时加入一个特异性的双标记荧光探针，建立了可用于检测血清4型FAV的特异性方法。特异性试验表明本方法特异性强，与其他几种家禽主要疫病（8a/b型FAV、NDV、H9亚型AIV、IBDV）均无交叉反应。灵敏度试验表明本技术的检测最小量可为100拷贝/μL。通过临床应用证实，该方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV，极大地缩短检测时间，可区分同期流行其他的主要血清型；同时避免了普通PCR的假阴/阳性情况。因此，本研究所建立的探针Real-timePCR技术具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于FAV样品的实验室检测。附图说明图1为FAV-4血清型的GF16分离毒株和WF816分离毒株Real-timePCR扩增曲线。图2为样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中：M为100bpDNALaddarMarker，1为样品的PCR扩增条带，2为阴性对照。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施例来进一步说明。实施例11.引物设计参照GenBank中FAV的基因组序列，设计一对引物（FAV-FQ-F、FAV-FQ-R）和探针P，标记荧光为FAM和Eclipse；引物由大连TaKaRa公司合成，HPLC级纯化；所述引物及探针序列如下：FAV-FQ-F：5'-CTAGGGTTCTGAACTTTG-3'（48-65），FAV-FQ-R：5'-CGGTAAACATTTCAAGGA-3'（190-173），扩增长度143bp；探针P：5'-(FAM）TGACGCCAGTTTCGCTTTCG(Eclipse)-3'（72-91）。2、Real-timePCR2.1DNA的提取选取肉鸡FAV分离毒株GF16和WF816进行检测，病毒DNA的提取按照TaKaRaDNAiso试剂操作进行，最后用30μL超纯水来溶解DNA；具体操作如下：将待检的病毒接种6日龄的SPF鸡胚的卵黄囊，收集接种后3~7d内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，冻融三次，混合后作为病毒液；上述病毒液，12000rpm离心2min，取0.2mL上清用DNA提取试剂盒提取DNA，最后溶于30溶于提超纯水中。OD值测定FAV病毒DNA的浓度为6.25。提取拷贝/贝2，-20℃保存备用；2.2Real-timePCRReal-timePCR采用PremixExTaq™(ProbeqPCR)进行，反应体系如下：2×qPCR反应液12.5μL（内含10UExTaqHS，5.0μmoLdNTPMixture）、PrimerFQ-F(10μM)0.5μL、PrimerFQ-R(10μM)0.5μL、Probe(5μM)1μL、DNA模板2μL、ddH2O8.5μL，共计25μL。Negativecontrol反应时，分别加入ddH2O代替DNA；Positive反应时，做2个平行样。荧光定量仪器为Bio-RadCFX96系列；PCR反应体系为：95℃30sec，随后95℃5sec、55℃10sec、72℃20sec进行40Cycles，反应结束后观察荧光曲线。同时取5µL反应产物进行3.0%琼脂糖凝胶电泳检验。以100bpDNALadder的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。结果分析：（一）Real-timePCR扩增：FAV-4血清型的GF16分离毒株和WF816分离毒株Real-timePCR扩增曲线良好(见图1)，2份样品的2个平行样品的Ct值基本一致，在19.3和19.8之间；阴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物FAV‑FQ‑F、FAV‑FQ‑R和探针P；（2）提取待检FAV病毒DNA，采用超纯水溶解；（2）采用设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物FAV-FQ-F、FAV-FQ-R和探针P；（2）提取待检FAV病毒DNA，采用超纯水溶解；（2）采用设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。2.根据权利要求1所述的双标记探针实时荧光PCR方法，其特征在于，所述引物的序列为：FAV-FQ-F：5'-CTAGGGTTCTGAACTTTG-3'，FAV-FQ-R：5'-CGGTAAACATTTCAAGGA-3'；所述探针的序列为：探针P：5'-(FAM）TGACGCCAGTTTCGCTTTCG(Eclipse)-3'。3.根据权利要求1或2所述的双标记探针实时荧光PCR方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应体系为：PremixExTaq™(ProbeqPCR)12....

【专利技术属性】
技术研发人员：袁小远，王友令，于可响，艾武，亓丽红，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37