新型抗菌肽DLP4的制备方法技术

本发明专利技术提供新型抗菌肽DLP4的制备方法，利用基因工程技术，通过对编码抗菌肽DLP4基因的优化，实现其在毕赤酵母中的重组表达。本发明专利技术首次实现抗菌肽DLP4在毕赤酵母基因工程菌中的表达，经测定发酵纯化产物对金黄色葡萄球菌ATCC 25923，ATCC 43300和ATCC 6538以及猪链球菌CVCC 606具有显著抑菌活性，MIC介于0.031‑2μg/ml。采用本发明专利技术方法制备的抗菌肽DLP4可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

Preparation method of novel antibacterial peptide DLP4

The invention provides a preparation method of a novel antibacterial peptide DLP4, and uses genetic engineering technology to optimize the recombinant DLP4 expression in Pichia pastoris by optimizing the encoding of an antibacterial peptide gene. The invention for the first time the expression of antimicrobial peptide DLP4 in Pichia pastoris in the determination of fermentation, purification of Staphylococcus aureus ATCC 25923, ATCC 43300 and ATCC 6538 and CVCC 606 Streptococcus suis has significant antibacterial activity, MIC between 0.031 and 2 g/ml. The antibacterial peptide DLP4 prepared by the method of the invention can be applied to the fields of antibacterial drugs, food additives, cosmetics, feed additives, etc., and has wide application value and market prospect.

【技术实现步骤摘要】
新型抗菌肽DLP4的制备方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种新型抗菌肽DLP4的制备方法。
技术介绍
黑水虻抗菌肽DLP4是SungMoonYoe研究组以黑水虻(亮斑扁角水虻，Hermetiaillucens)为原料，通过金黄色葡萄球菌(S.aureusKCCM40881)进行免疫刺激从而产生的高效抗G+菌活性抗菌肽。抗菌肽DLP4是含有95个氨基酸残基的多肽序列，其中1～24位是信号肽序列，25～40位为前导肽序列，41～81位为成熟肽(DLP4)序列。DLP4理论分子量分别为4275.0Da，DLP4具有2个组氨酸(His)、4个赖氨酸(Lys)以及4个精氨酸(Arg)，在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，净电荷数在+4到+6之间变化(Soon-IkPark等，ParkSI,KimJW,YoeSM.Purificationandcharacterizationofanovelantibacterialpeptidefromblacksoldierfly(Hermetiaillucens)larvae.[J].Developmental&ComparativeImmunology,2015,52(1):98-106.)。抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高(基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高)等一直是抗菌肽应用中面临的挑战。目前，尚未见到有关于DLP4在毕赤酵母中进行转基因表达的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新型抗菌肽DLP4的制备方法。本专利技术的另一目的是提供一种可高效分泌表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的新型抗菌肽DLP4的制备方法，包括以下步骤：1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP4的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；2)重组酵母表达载体的构建：将SEQIDNo:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP4；3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP4经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌；4)抗菌肽DLP4的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP4。前述的方法，步骤4)具体为：①种子液制备：挑取单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养18～24h；然后按1％的接种量，转接至YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养16～18h，OD600达到4～6；然后，按10％接种量接到上罐培养基(含4.8‰PMT1)中，即200ml菌液+200ml45％葡萄糖+9.6mlPMT1，装液量为2L/5L，于29℃，800rpm，pH5.0，pO2>35％的条件下培养16-18h；②添加葡萄糖生长阶段：观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加时间6-8h，流速为30ml/L/h；③甲醇过渡诱导：添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加含12‰PMT1的无水甲醇，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束；④100％甲醇诱导阶段：甲醇过渡诱导6h后，开始100％甲醇连续诱导，流速为6ml/L/h；甲醇诱导开始后，每12h取样，测定重组酵母菌分泌表达抗菌肽DLP4的水平。前述的方法，步骤4)中采用阳离子交换层析对上清进行纯化。具体操作如下：发酵液于4℃，12000rpm离心10min后取上清，将长度16mm、内径10mm的HiPrepSPFF阳离子交换柱(GEHealthcare)用A液平衡5-10个柱体积后上样；进样完毕后，先用A液进行洗脱，待穿透峰洗脱完后，用B液进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱步骤为：100％A液，洗脱5个柱体积，为穿透峰；40％A，60％B液，洗脱5个柱体积，为洗脱峰；利用UV215nm监测洗脱情况，Tricine-SDS-PAGE和检测目标产物纯化情况。其中，所述A液为20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液，所述B液为含有1MNaCl的20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液。收集到的洗脱峰，经1KDa截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次；收集透析后的透析液，于-54℃，0.016MPa条件下进行真空冷冻干燥，通过Tricine-SDSPAGE凝胶电泳检测纯化后的抗菌肽DLP4。本专利技术还提供一种分泌表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌，其构建方法包括以下步骤：1)对抗菌肽DLP4的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；2)将SEQIDNo:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP4；3)载体pPICDLP4经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，即得分泌表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌。本专利技术通过实验证实了利用构建的重组酵母菌所分泌表达的抗菌肽DLP4，其对革兰氏阳性细菌具有强烈杀伤作用。检测了抗菌肽DLP4对不同来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度(MIC)在0.015-0.236μm之间，明显优于氨苄西林(Ampicillin)(2.69-6.73μm)。另外，DLP4对猪链球菌(Streptococcussuis)的MIC值介于0.015和0.118μM之间，同样优于氨苄西林5倍左右。本专利技术通过对编码抗菌肽DLP4的基因进行酵母偏爱密码子优化，构建至pPICZαA载体上，首次实现其在毕赤酵母X-33中分泌表达。通过对酵母重组菌株进行高密度诱导发酵，120h发酵后抗菌肽DLP2产量高达1600mg/L左右，可获得纯度高于90％的抗菌肽DLP4产品。采用本专利技术方法制备的抗菌肽DLP4可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。附图说明图1为本专利技术实施例2中DLP4的PCR扩增产物及质粒载体pPICZαA提取电泳图；其中，M1：DNA分子量Marker；M2：Trans5KMarker；4：DLP4；5：pPICZαA。图2为本专利技术实施例3中线性化重组载体电泳图；其中，M:Trans5KMarker；4：pPICDLP4线性化产物；5：阴性对照。图3为本专利技术实施例4中DLP4发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳图；M：超低分子量蛋白Mark本文档来自技高网...

【技术保护点】
新型抗菌肽DLP4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP4的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；2)重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP4；3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP4经线性化后转化感受态毕赤酵母X‑33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌；4)抗菌肽DLP4的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP4。

【技术特征摘要】
1.新型抗菌肽DLP4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP4的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；2)重组酵母表达载体的构建：将SEQIDNo:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP4；3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP4经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌；4)抗菌肽DLP4的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP4。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为：①种子液制备：挑取单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养18～24h；然后按1％的接种量，转接至YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养16～18h，OD600达到4～6；然后，按10％接种量接到上罐培养基中，即200ml菌液+200ml45％葡萄糖+9.6mlPMT1，装液量为2L/5L，于29℃，800rpm，pH5.0，pO2>35％的条件下培养16-18h；②添加葡萄糖生长阶段：观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加时间6-8h，流速为30ml/L/h；③甲醇过渡诱导：添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加含12‰PMT1的无水甲醇，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束；④100％甲醇诱导阶段：甲醇过渡诱导6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，李占占，王秀敏，毛若雨，滕达，郝娅，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11