纳米孔RNA表征方法技术

本发明专利技术涉及通过随着目标RNA多核苷酸相对于跨膜孔移动，获取一个或多个测量值来表征目标RNA多核苷酸的新方法。通过DNA解旋酶控制该移动。本发明专利技术也涉及修饰的RNA构建体，其中所述RNA多核苷酸已被修饰以增强DNA解旋酶对其的结合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纳米孔RNA表征方法
本专利技术涉及通过随着目标RNA多核苷酸相对于跨膜孔移动，获取一个或多个测量值来表征所述目标RNA多核苷酸的新方法。所述目标RNA多核苷酸相对于所述跨膜孔的移动通过DNA解旋酶控制，并且修饰所述目标RNA多核苷酸以增强DNA解旋酶对其的结合。本专利技术还涉及被修饰的RNA的构建体，其中所述RNA多核苷酸已被修饰以增强DNA解旋酶对其的结合。
技术介绍
目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。当跨纳米孔施加电势时，当分析物如核苷酸在桶(桶状体)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。信使RNA提供了对生物体动态的观察，并且直接RNA测序的益处和应用是巨大的，包括用于健康筛查；例如某些癌症的转移过程和心脏病。直接RNA测序能在调查农作物的抗病性中应用，确定农作物对应激因素，例如干旱、紫外线和盐度的反应，以及在胚胎发育过程的细胞分化和决定中应用。存在于RNA，特别是500个或更多的核苷酸的RNA的直接测序中的问题是寻找合适的能够控制RNA穿过跨膜孔的移位的分子马达。至今，用于RNA并提供持续移动的分子马达还没有出现。对于表征或测序多核苷酸，需要RNA聚合物的持续移动和读取长片段聚合物的能力。国际专利申请No.PCT/GB2014/053121(WO2015/056028)公开了表征目标核糖核酸(RNA)的方法，包括形成互补多核苷酸，然后使用跨膜孔表征所述互补多核苷酸。这种间接RNA表征易于出错并可能导致关于例如，RNA的甲基化状态的重要信息的丢失。RNA到cDNA的转换过程中其他重要的修饰也可能被隐藏。
技术实现思路
本专利技术人出乎意料地证明了在DNA解旋酶的控制下，可以通过随着目标RNA多核苷酸相对于跨膜孔移动，获取一个或多个测量值来表征所述目标RNA多核苷酸。相应地，在一个具体实施方式中，提出了用于提高要被测序的RNA穿过孔的能力和效率的方法。在另一具体实施方式中，也提出制备被修饰的RNA的方法，所述被修饰的RNA比未修饰形式的RNA能以更高效率穿过孔而被测序。本专利技术提供的一种表征目标RNA多核苷酸的方法，包括：a)提供(i)RNA多核苷酸和(ii)DNA解旋酶，其中所述RNA多核苷酸被修饰以包含非-RNA多核苷酸；b)将a)中提供的所述RNA多核苷酸和DNA解旋酶与跨膜孔接触，使得所述DNA解旋酶控制所述RNA多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；c)随着所述RNA多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述RNA多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标RNA多核苷酸。修饰所述RNA多核苷酸以包含非-RNA多核苷酸(例如多核苷酸区域或序列或构建体)导致了增强的DNA解旋酶对其的结合。在此定义的"非-RNA多核苷酸"是多核苷酸，其中所述多核苷酸的至少一个核苷酸不是核糖核苷酸，即不是来自RNA。所述非-RNA多核苷酸因此可以包含至少一个核糖核苷酸(或RNA核苷酸)，但必须额外包含或包括非-RNA核苷酸或序列，即不是RNA的核苷酸或核苷酸序列。在本专利技术的优选的实施方式中，所述非-RNA多核苷酸(其可能或可能不包含至少一个核糖核苷酸或RNA核苷酸)包含DNA或DNA类似物，优选DNA解旋酶结合位点或DNA适配器。优选地所述非-RNA多核苷酸包含优先地穿入所述孔的前导序列。因此首先读取所述非-RNA多核苷酸，然后读取要被表征的目标RNA序列。本专利技术提供的"杂交的"多核苷酸的构建体，包含(i)RNA多核苷酸和(ii)非-RNA多核苷酸。优选地所述非-RNA多核苷酸包含DNA多核苷酸，其中所述DNA多核苷酸包含或仅包含DNA解旋酶结合位点。优选地所述非-RNA多核苷酸进一步包含前导序列，其优先地穿入纳米孔。更优选地所述非-RNA多核苷酸进一步包含在多核苷酸链上的条形码部分。所述条形码部分优选地位于所述前导序列和所述DNA解旋酶结合位点之间。所述条形码部分使得能够清楚地识别分析物，即通知使用者多个样品中哪个被测序。修饰目标RNA多核苷酸以包含非-RNA多核苷酸可包括使用任何合适的连接方法，包括在此描述的一个或多个的连接方法，将非-RNA多核苷酸(可能包含RNA序列或至少一个核糖核苷酸)连接到所述目标RNA多核苷酸。正如本文所述，将非-RNA多核苷酸连接到目标RNA与将目标RNA连接到非-RNA多核苷酸同义。其中所述非-RNA多核苷酸包含核糖核苷酸或RNA序列，所述非-RNA多核苷酸可以通过包含在所述非-RNA多核苷酸内的核糖核苷酸或RNA连接到所述目标RNA多核苷酸。所述非-RNA多核苷酸可以通过共价键连接到所述目标RNA多核苷酸，所述共价键形成在所述目标RNA多核苷酸和所述非-RNA多核苷酸的各自至少一个反应基团之间。所述非-RNA多核苷酸可以用化学方法地或酶促地连接到所述RNA多核苷酸。通过杂交和/或使用一个或多个拓扑异构酶，所述非-RNA多核苷酸可以额外地或替换地连接到所述RNA多核苷酸。优选地通过所述方法确定的一个或多个特征选自(i)所述RNA多核苷酸的长度，(ii)所述RNA多核苷酸的同一性，(iii)所述RNA多核苷酸的序列，(iv)所述RNA多核苷酸的二级结构和(v)所述RNA多核苷酸是否是修饰的。所述RNA多核苷酸的一个或多个特征可以通过电测量和/或光测量来测量。优选地步骤c)包括随着所述RNA多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，测量流过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述RNA多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述RNA多核苷酸。要被表征的目标RNA多核苷酸可以额外地或进一步通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白，或用一个或多个标记物、标签或间隔器进行修饰。所述目标RNA可以包含碱基类似物。所述RNA多核苷酸可以使用一个或多个锚耦合到所述膜。优选地所述DNA解旋酶包含减小多核苷酸结合域中开口的大小的修饰，所述RNA多核苷酸可以在至少一个构象状态下穿过所述开口从所述解旋酶上解绑。在本专利技术的一个实施方式中，通过一系列的一个或多个DNA解旋酶控制所述RNA多核苷酸的移动。所述一个或多个解旋酶为a)Hel308解旋酶、RecD解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶；(b)衍生自(a)中所述任何解旋酶的解旋酶；或(c)(a)和/或(b)中所述解旋酶的任意组合。所述方法可以进一步包含使用一个或多个衍生自解旋酶的分子制动器，所述分子制动器被修饰使得其结合多核苷酸但不发挥解旋酶的功能。所述跨膜孔可以是蛋白孔或固态孔。优选地所述跨膜蛋白质孔是蛋白孔，并衍生自溶血素、杀白细胞素，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白A(MspA)、MspB、MspC、M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表征目标RNA多核苷酸的方法，包括：a)提供(i)RNA多核苷酸和(ii)DNA解旋酶，其中所述RNA多核苷酸被修饰以包含非‑RNA多核苷酸；b)将a)中提供的所述RNA多核苷酸和DNA解旋酶与跨膜孔接触，使得所述DNA解旋酶控制所述RNA多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；c)随着所述RNA多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述RNA多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标RNA多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.17 GB 1418459.2;2015.05.14 GB 1508270.4;201.一种表征目标RNA多核苷酸的方法，包括：a)提供(i)RNA多核苷酸和(ii)DNA解旋酶，其中所述RNA多核苷酸被修饰以包含非-RNA多核苷酸；b)将a)中提供的所述RNA多核苷酸和DNA解旋酶与跨膜孔接触，使得所述DNA解旋酶控制所述RNA多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；c)随着所述RNA多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述RNA多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标RNA多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非-RNA多核苷酸包含DNA解旋酶结合位点或DNA适配器。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA解旋酶结合位点或所述DNA适配器包含前导序列。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述前导序列优先地穿入所述跨膜孔。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过共价键将所述非-RNA多核苷酸连接到所述RNA多核苷酸，所述共价键形成在所述RNA多核苷酸和所述非-RNA多核苷酸的各自至少一个反应基团之间。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过化学或酶促连接将所述非-RNA多核苷酸连接到所述RNA多核苷酸。7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述非-RNA多核苷酸杂交到所述RNA多核苷酸。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述RNA多核苷酸的长度，(ii)所述RNA多核苷酸的同一性，(iii)所述RNA多核苷酸的序列，(iv)所述RNA多核苷酸的二级结构和(v)所述RNA多核苷酸是否是修饰的。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述RNA多核苷酸的一个或多个特征通过电测量和/或光测量来测定。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤c)包括随着所述RNA多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，测量流过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述RNA多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述RNA多核苷酸。11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述RNA多核苷酸包括通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白，碱基类似物或用一个或多个标记物、标签或间隔器进行修饰。12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述RNA多核苷酸使用一个或多个锚耦合到所述膜。13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述DNA解旋酶包含修饰，以减小所述多核苷酸结合域中开口的大小，...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·赖安·加拉尔达，安德鲁·约翰·赫伦，拉科马·贾亚辛格，丹尼尔·约翰·特纳，詹姆斯·怀特，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB