一种定量检测血清中葡萄糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速、灵敏的血清中葡萄糖的定量检测方法。属于生物化学试剂检测领域。该方法先以有机溶剂去除血清中的蛋白质，经过结构中含有硼酸基团和季铵基团化学标记后，采用黑磷辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱分析，进而实现血清中葡萄糖的定量检测。该方法操作简单快速，可在5分钟内完成整个实验流程；消耗的样品量少，仅在0.5微升血清中就可实现内源性葡萄糖的检测；结果准确，满足大规模测定样本的要求。

A rapid and sensitive method for quantitative determination of glucose in serum

The invention discloses a fast and sensitive quantitative detection method of glucose in serum. The utility model belongs to the field of biochemical reagent detection. The methods using organic solvent to remove serum protein, after containing boric acid groups and quaternary ammonium groups chemical marker structure, using black phosphorus analysis assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, and then realize the quantitative detection of glucose in serum. This method is simple and fast, can be completed within 5 minutes the whole experiment process; sample consumption less, can detect endogenous glucose only in serum in 0.5 microliter; accurate determination of sample requirements to meet the large-scale.

【技术实现步骤摘要】
一种快速、灵敏的血清中葡萄糖的定量检测方法
本专利技术属于生物化学试剂检测领域，具体涉及一种准确、快速和灵敏的血清中葡萄糖的定量检测方法。
技术介绍
葡萄糖(glucose)是一种己糖，人体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自血液中的葡萄糖。血液中葡萄糖含量的高低是糖尿病诊断的重要指标。而且，血液中葡萄糖水平的持续增高会引发一系列并发症，比如视网膜病、神经性疾病和心血管疾病等。近年来，关于血液中葡萄糖含量与胰腺癌、肝癌、结肠癌等癌症的密切关系也受到了广泛关注。因此，已经相继报道了很多检测血液中葡萄糖的方法。近几年，基于电化学和光学技术的葡萄糖传感器因成本较低的优点，得到了普遍应用；但是此类技术存在信号干扰和灵敏度低的缺点。基于此，凭借高准确度和高灵敏度的优点，色谱-质谱联用的方法被应用到血液中葡萄糖的定量检测中；但是，因为葡萄糖需要经过气相分离或液相分离过程，所以该方法存在耗时的缺点，无法实现高通量。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱具有准确、高通量、高灵敏度和样品消耗量低的优点，有望在血液中葡萄糖的检测方面发挥重要作用，但是该技术在低分子量区域存在基质信号干扰以及信号重现性差的问题，这对血液中葡萄糖的定量检测造成极大的困难。准确、高通量和低样品用量是临床检测的基本要求。所以，为了获得可靠的临床诊断结果，需要建立一种准确、灵敏和快速的方法对血液中的葡萄糖进行检测。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种准确、高通量和高灵敏度的策略，实现血清中葡萄糖的定量检测。本专利技术的第一方面，提供一种定量检测血清中葡萄糖的试剂盒，包括同位素内标[2H4]葡萄糖、乙腈、结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂。进一步的，所述结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂是2-(4-苯硼酸)异喹啉氮鎓溴化物或1-(4-苯硼酸)吡啶氮鎓溴化物。本专利技术的第二方面，提供一种基于上述试剂盒定量检测血清中葡萄糖的方法，包括以下步骤：1)除蛋白：准确量取0.5微升血清后将其置于200微升离心管中，加入0.5微升，2毫克/毫升的同位素内标[2H4]葡萄糖，加入1.5微升乙腈除蛋白，然后以12000rpm转速高速离心1min后取上清液；2)化学标记：向步骤1)除蛋白后的上清液中加入0.5微升，10毫克/毫升结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂，然后在700W的微波炉中高火反应3min；3)制备标准曲线：配制含葡萄糖标准品的溶液，葡萄糖标准品的浓度变化范围为0.02-50mmol/L,其中同位素内标[2H4]葡萄糖固定为5.56mmol/L，每个浓度的样品做三次平行，按照步骤2)所述进行化学标记后将样品按照浓度从低到高顺序进行黑磷辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析，以浓度为横坐标，以葡萄糖化学标记产物的峰强对同位素内标[2H4]葡萄糖化学标记产物的峰强的比值为纵坐标，制得工作曲线；4)检测：将步骤2)中反应后的溶液进行黑磷辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(Blackphosphorusassistedlaserdesorptioninonization-timeofflightmassspectrometry,BP/ALDI-TOFMS)分析，获得血清中葡萄糖与同位素内标化学标记产物的质谱图峰强之比，根据步骤3)的工作曲线计算出葡萄糖的浓度。在本专利技术的一个优选实施例中，上述衍生化试剂是2-(4-苯硼酸)异喹啉氮鎓溴化物，其合成方法为：将4-溴甲基苯基硼酸(0.1克，0.5毫摩)溶解于10毫升乙醚中，然后在搅拌下逐滴加入0.25毫升异喹啉，在室温下搅拌8小时，产物即以白色沉淀的形式析出，然后依次用10毫升乙醚清洗三次；最后，将得到的白色固体粉末放于真空干燥箱中，干燥12小时，即得到2-(4-苯硼酸)异喹啉氮鎓溴化物，该试剂结构中含有硼酸基团和季铵基团。在本专利技术的另一个优选实施例中，上述衍生化试剂是1-(4-苯硼酸)吡啶氮鎓溴化物，其合成方法为：将4-溴甲基苯基硼酸(0.1克，0.5毫摩)溶解于10毫升乙醚中，然后在搅拌下逐滴加入0.15毫升吡啶，将该混合物在室温下搅拌8小时，产物即以白色沉淀的形式析出；接着，依次用10毫升乙醚清洗三次；最后，将得到的白色固体粉末放于真空干燥箱中，干燥12小时，即得到1-(4-苯硼酸)吡啶氮鎓溴化物，该试剂结构中含有硼酸基团和季铵基团。本专利技术的原理是：采用准确、高通量、高灵敏度和样品消耗量低的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测血液中葡萄糖，通过向血清样品中加入同位素内标的目的是校正样品前处理的损失和仪器信号的波动，解决了基质辅助激光解吸电离质谱信号重现性差的问题；将黑磷作为基质辅助激光解吸电离质谱的基质时，低分子量区域的谱图非常干净，解决了基质辅助激光解吸电离质谱分析小分子时的信号干扰问题；由于硼酸可与1,2或1,3顺式二羟基形成共价的五元或六元环状硼酸酯，说明硼酸试剂可以选择性地与葡萄糖中的顺式二羟基反应；此外，黑磷辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析策略对季铵盐类化合物有很强的响应，所以，上述步骤2)中葡萄糖通过结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂以合适的化学路径转换成季铵盐化合物，这样试剂中的硼酸基团可以从复杂的血清基质中选择性捕获葡萄糖并与之反应，使其标记上化学基团，增强了选择性和灵敏度，同时获得黑磷辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的检测基团。其原理见附图1。本专利技术以化学标记结合黑磷辅助激光解吸-飞行时间质谱分析实现了对血清中的葡萄糖的准确、快速和高灵敏的定量分析。整个分析过程，包括样品处理和检测，在5分钟内即可完成；需要的样品量很少，仅在0.5微升的血清中实现了内源性葡萄糖的测量，结果准确，满足大规模测定样本的要求。附图说明图1是实验原理图；图2是应用本专利技术所提供的血清中内源性葡萄糖的2-(4-苯硼酸)异喹啉化学标记产物的黑磷辅助激光解吸-飞行时间质谱图；图3是葡萄糖标准品的2-(4-苯硼酸)异喹啉化学标记产物的黑磷辅助激光解吸-飞行时间质谱图，插入的元素是葡萄糖化学标记产物的结构式、分子量以及检出限(limitofdetection，LOD)；图4是应用本专利技术所提供的血清中内源性葡萄糖的1-(4-苯硼酸)吡啶化学标记产物的黑磷辅助激光解吸-飞行时间质谱图；图5是葡萄糖标准品的1-(4-苯硼酸)吡啶化学标记产物的黑磷辅助激光解吸-飞行时间质谱图，插入的元素是葡萄糖化学标记产物的结构式、分子量以及检出限；图6是分别采用本专利技术的方法和临床上己糖激酶的方法对血清中葡萄糖的的定量结果的回归曲线；附图中各部件的标记如下：1、血清中内源性葡萄糖的2-(4-苯硼酸)异喹啉化学标记产物；2、同位素内标[2H4]葡萄糖的2-(4-苯硼酸)异喹啉化学标记产物；3、血清中内源性葡萄糖的1-(4-苯硼酸)吡啶化学标记产物；4、同位素内标[2H4]葡萄糖的1-(4-苯硼酸)吡啶化学标记产物。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。【实施例1】2-(4-苯硼酸)异喹啉氮鎓溴化物标记结合黑磷辅助激光解吸电离-飞行时间质谱用于血清中葡萄糖的检测制备标准曲线：配制含葡萄糖标准品的溶液，其浓度依次为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测血清中葡萄糖的试剂盒，其特征在于，包括同位素内标[

【技术特征摘要】
1.一种定量检测血清中葡萄糖的试剂盒，其特征在于，包括同位素内标[2H4]葡萄糖、乙腈、结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂是2-（4-苯硼酸）异喹啉氮鎓溴化物或1-（4-苯硼酸）吡啶氮鎓溴化物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的2-（4-苯硼酸）异喹啉氮鎓溴化物是由以下方法制备获得：将4-溴甲基苯基硼酸（0.1克，0.5毫摩）溶解于10毫升乙醚中，然后在搅拌下逐滴加入0.25毫升异喹啉，在室温下搅拌8小时，产物即以白色沉淀的形式析出，然后依次用10毫升乙醚清洗三次；最后，将得到的白色固体粉末放于真空干燥箱中，干燥12小时，即得到2-（4-苯硼酸）异喹啉氮鎓溴化物。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的1-（4-苯硼酸）吡啶氮鎓溴化物是由以下方法制备获得：将4-溴甲基苯基硼酸（0.1克，0.5毫摩）溶解于10毫升乙醚中，然后在搅拌下逐滴加入0.15毫升吡啶，将该混合物在室温下搅拌8小时，产物即以白色沉淀的形式析出；接着，依次用10毫升乙醚清洗三次；最后，将得到的白色固体粉末放于真空干燥箱中，干燥12小时，即得到1-（...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯钰锜，王青，余磊，丁俊，何小梅，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42