一种铜藻种质资源的离体保存方法技术

本发明专利技术提供一种铜藻种质资源离体保存的方法，其中更实用的种质保存培养液是在灭菌海水中加入0.1mol/L的NaNO3，0.1mol/L的NaH2PO4和1mg/L烯效唑。本发明专利技术所提供的方法进行铜藻离体保存，可大大延长了铜藻藻株主枝的保存时间。经保存的材料可快速恢复生长，并能进行大量繁殖，大量繁殖所获得的种苗与未经保存过的种苗相比，其形态特征和长势无明显差异。本发明专利技术的方法可在短期内提供大量的铜藻优质种苗，有效解决了铜藻种质资源保存及规模化育苗问题，具有广泛的应用前景。

In vitro conservation method for copper algae Germplasm Resources

The present invention provides a method for in vitro conservation of copper algae germplasm resources, wherein, the more practical germplasm preserving culture solution is NaNO3, 0.1mol/L, NaH2PO4, 1mg/L and Uniconazole of 0.1mol/L in sterilized sea water. The method provided by the invention of copper algae in vitro conservation, can greatly extend the copper algae strain carried save time. The stored material can recover rapidly and can carry out a lot of propagation. The seedlings and seedlings obtained by mass propagation have no obvious difference in morphological characteristics and growth vigor compared with those without storage. The method of the invention can provide a large number of high-quality copper algae seedlings in the short term, effective solution to the preservation of germplasm resources and the scale of copper algae seedlings, and has wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种铜藻种质资源的离体保存方法
本专利技术属于藻类组织培养
，具体涉及一种铜藻种质资源的离体保存方法。
技术介绍
铜藻Sargassumhorneri(Turner)C.Agardh隶属于马尾藻属(Sargassum)，是近海海洋生态环境的重要组成部分，不仅可为经济鱼类提供觅食和栖息场所，还可吸附海水中的富营养化物质和重金属等，作为修复近海生态环境的工具海藻，是一类重要的经济褐藻。近年来，随着人们对其研究的逐渐深入，铜藻中富含的褐藻胶、岩藻黄素、膳食纤维、多糖等生物活性物质引起了国内外的普遍关注，被广泛应用到医药、食品、饲料和有机肥料等方面。随着铜藻资源的开发利用，加上受近岸海域开发和污染的影响，造成其资源量不断下降，因此在保护现有野生资源的同时，利用藻类组织培养方法对具有优良性状的铜藻种质资源进行离体保存对开展它的人工苗种繁育和海区增殖都有重要的意义。离体培养保存正日益成为大型经济海藻种质资源保存的常用手段，但普遍存在的问题就是继代频繁，每一次继代都可能造成交叉污染，而当保存量较大时，继代培养所消耗的人力和物力成本很高。另外，铜藻藻体较大，生长速度快，在实验室不易长时间保持其藻体的正常活性，给铜藻种质资源的离体保存带来很大困难。目前，国内外对铜藻的研究主要集中在生态学、人工增养殖和繁殖生物学等方面，但有关其种质资源保存的研究还比较少。中国专利技术专利“一种利用低温保存铜藻受精卵的方法”(公布号为CN104145946A的)中公开了利用低温保存铜藻受精卵的方法，该方法是将受精卵于4-8℃下保存，使其在假根伸长之前完成异地跨地区运输从而进行苗种培育，而对于铜藻种质的室内离体培养保存目前尚无有效的保存方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种铜藻种质资源离体保存的方法，从而有效的进行铜藻种质资源的离体保存。本专利技术的铜藻种质资源离体保存的方法，包括如下的步骤：1)将要进行保存的铜藻种质资源进行清洗；2)将清洗好的铜藻取藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～30s，然后用消毒海水快速冲洗3～4次，冲洗后灭菌条件下切取藻株主枝尖端作为离体保存的对象；所述的藻株主枝尖端，其长度优选为8～12cm3)将切取的藻株主枝尖端放入保存培养基中，在5～8℃、光照强度为2000～2500lx，光周期为10L:14D，充气条件下进行保存；定期更换培养基所述的述的种质保存培养液是在灭菌海水中加入0.1mol/L的NaNO3，0.1mol/L的NaH2PO4和1mg/L烯效唑；所述的培养液优选每10天更换一次；所述的光照由白色荧光灯提供；4)待保存的藻株主枝生长到长度不短于15厘米时，去掉藻株主枝的基部，将保留的藻株尖端继续放入种质保存培养液中进行种质保存培养。(5)所述保存后恢复生长步骤为：取出离体保存6个月的藻体，转入外尺寸为长80cm×宽45cm×高40cm的循环水箱中，培养液为正常海水。培养条件为：温度10～15℃，光照强度4000～5000lx，光周期12L:12D，充气量较大，使藻体上下翻滚，每7天换水量为总水体的50％，藻体保持旺盛生长，经过约15～20天的培养，藻体长至20厘米以上，即可用于后续育苗使用。本专利技术所提供的方法进行铜藻离体保存，可大大延长了铜藻藻株主枝的保存时间。经保存的材料可快速恢复生长，并能进行大量繁殖，大量繁殖所获得的种苗与未经保存过的种苗相比，其形态特征和长势无明显差异。本专利技术的方法可在短期内提供大量的铜藻优质种苗，有效解决了铜藻种质资源保存及规模化育苗问题，具有广泛的应用前景。附图说明图1：添加不同浓度烯效唑的培养液对叶绿素a含量的影响图；图2：添加不同浓度烯效唑的培养液对类胡萝卜素含量的影响图。具体实施方式申请人研究中发现，用灭菌海水对铜藻主枝尖端进行培养保存，30d时即出现藻体颜色明显变浅，尖端发白等表观性状，通过对其叶绿素a和类胡萝卜素含量的测定发现均明显降低。所以，本申请配制保存培养基的目的就是为了在保存过程增加藻体的干重，并保持叶绿素a和类胡萝卜素的含量。下面对本专利技术的方法进行详细的描述。实施例1本实施例所配制的种质保存培养液，其组分如下：加入0.1mol/LNaNO3，0.1mol/LNaH2PO4，1mg/L烯效唑的灭菌海水。上述组分及配比，既可以延缓铜藻保存时的生长速度，又不影响其保存后的恢复生长。对铜藻的保存步骤如下：(1)选择具有优良性状的铜藻种质，用毛刷和镊子清除表面的附着生物，然后用海水反复清洗去除泥沙及杂质；(2)将处理好的铜藻放在超净工作台上，取藻体主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～30s，然后用大量消毒海水快速冲洗3～4次，用灭菌的解剖刀切取藻体主枝尖端10厘米的片段作为离体保存的对象；(3)种质保存的条件为：在容积为1000mL的三角瓶中进行，每个三角瓶装800mL培养液，放置两株藻体，微量充气，使培养液表面有小气泡冒出；保存温度为5～8℃，光照强度为2000～2500lx，光周期为10L:14D，由白色荧光灯提供。(4)定期观察保存藻体的生长情况，与对照(正常灭菌海水中培养)相比，藻体生长缓慢，长度明显缩短，主枝明显增粗，约30天左右，藻体长度长至15厘米左右，用解剖刀剪去基部，仅保留尖端10厘米的藻体片段，再继续放入种质保存培养液中进行种质保存培养。不同培养液、温度、光照强度、充气大小对保存效果的影响如下所示，测定的生长指标包括藻体的鲜质量(freshweight,FW)、藻体长度以及表观症状等，其中鲜质量的增加量以比生长速率(relativegrowthrate,RGR)表示，计算公式如下：RGR＝[(Wt/W0)1/t-1]×10式中Wt为实验中期或结束时藻体鲜重(g)，W0为实验开始时藻体鲜重(g)，t为培养时间(d)。(1)培养液对铜藻离体保存的影响将试验材料放入不同浓度烯效唑的培养液中保存，每组处理三个平行，保存条件：温度10℃，光照强度2500lx，光周期12L:12D，微量充气。结果表明，铜藻在烯效唑浓度为1.0mg/L保存时间最长，为182天，具体情况见表1。表1不同培养液对铜藻种质资源保存效果(2)温度对铜藻离体保存的影响将试验材料放入本专利技术的保存培养基中，分别放置于温度5℃，8℃，10℃，15℃的光照培养箱保存，每组处理三个平行，其他保存条件：光照强度2500lx，光周期12L:12D，微量充气。结果表明，铜藻在温度为5℃培养箱中保存时间最长，为187天。具体情况见表2。表2不同温度对铜藻种质资源保存效果(3)光照强度对铜藻离体保存的影响将试验材料放入本专利技术的保存培养基中，分别放置于1000lx，1500lx，2000lx，2500lx，3000lx的光照强度下保存，每组处理三个平行，其他保存条件：温度10℃，光周期12L:12D，微量充气。结果表明，铜藻在光照强度为2000lx保存时间最长，为187天，具体见表3。表3不同光照强度对铜藻种质资源保存效果(4)充气量对铜藻离体保存的影响将试验材料分别放置于不充气，微量充气(培养液表面有小气泡冒出)，充气量大(藻体上下翻滚)下保存培养，温度10℃，光照强度2500lx，光周期12L:12D。结果表明，铜藻在充气量较小的条件下保存时间最长，为157天，具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜藻种质资源离体保存的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)将要进行保存的铜藻进行清洗；2)将清洗好的铜藻取藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～30s，然后用消毒海水快速冲洗3～4次，冲洗后灭菌条件下切取藻株主枝尖端作为离体保存的对象；3)将切取的藻株主枝尖端放入保存培养基中，在5～8℃、光照强度为2000～2500lx，光周期为10L:14D，充气条件下进行保存；定期更换培养基4)待保存的藻株主枝生长到长度不短于15厘米时，去掉藻株主枝的基部，将保留的藻株尖端继续放入种质保存培养液中进行种质保存培养。

【技术特征摘要】
1.一种铜藻种质资源离体保存的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)将要进行保存的铜藻进行清洗；2)将清洗好的铜藻取藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～30s，然后用消毒海水快速冲洗3～4次，冲洗后灭菌条件下切取藻株主枝尖端作为离体保存的对象；3)将切取的藻株主枝尖端放入保存培养基中，在5～8℃、光照强度为2000～2500lx，光周期为10L:14D，充气条件下进行保存；定期更换培养基4)待保存的藻株主枝生长到长度不短于15厘米时，去掉藻株主枝的基部，将保留的藻株尖端继续放入种质保存培养液中进行种质保存培养。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕芳，丁刚，郭文，詹冬梅，吴海一，
申请(专利权)人：山东省海洋生物研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37