一种高效分离微藻种质资源的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效分离微藻种质资源的方法。它是将待分离样品均匀地滴或喷在琼脂培养基“槽纹”平板上，并使样品流进平板的“槽纹”中，将培养皿封口进行培养，若上述“槽纹”平板中出现绿色、蓝色、褐色或紫色的单藻落，即为待分离样品中的微藻种类，挑出单藻落进行进一步的纯化，即可获得纯化的微藻藻种；所述的琼脂培养基“槽纹”平板是指在琼脂培养基上具有许多的“槽纹”。本发明专利技术通过琼脂培养基“槽纹”平板，实现高效分离微藻种质资源的目的。“槽纹”接种避免涂布造成的细胞损伤，又能较长时间地为藻细胞提供相对稳定的“微环境”，有利于细胞稳定分裂增殖，在短时间内获得纯化微藻种质，容易获得采用一般分离方法难以获得的微藻种质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微藻生物
，具体涉及一种从待分离样品中高效分离微藻种质资源的方法。
技术介绍
微藻是一类能进行光合作用的自养微生物，具有生长周期短、光合效率高、细胞代谢产物种类丰富等特点。同时，微藻细胞主要成分是多糖、蛋白质、色素和脂肪酸等有应用价值的活性物质。因此，微藻在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域都展现出很好的开发前景。微藻分布广泛，在陆地、海洋、淡水湖泊，雪山、森林、甚至一些比较极端的环境如高温的温泉中均有发现。微藻种类繁多，据估计全球超过5万余种，然而，迄今已知的约3万种，实现工业化应用的不超过20种。其中，真正大规模产业开发的主要是螺旋藻、小球藻、盐藻和雨生红球藻等数种。这些藻类均具有以下的一个或数个特点：对高碱和(或)高盐的适应性强、生长快速或富含高值化的活性物质。因此，优良的藻种是微藻实现工业化应用的基础和关键。利用基因工程手段针对性地改良微藻特性是微藻生物技术发展的一个方向，然而迄今对藻类的各种功能基因和代谢途径等方面的了解还比较欠缺，遗传改良的研究工作开展得并不多。从自然界中分离微藻种质资源是筛选、获得生产性状稳定、抗逆性好、活性物质丰富的野生藻株的基础工作。目前，用于微藻分离的技术方法有以下几种：微细吸管(毛细管)分离法、水滴分离法、稀释分离法、琼脂平板法即固体培养基分离法。这些方法都存在一些不足：微细吸管(毛细管)分离法一般只适于分离个体较大的藻类，并对操作者要求有较高的技术熟练程度、需要足够的细心和耐心；水滴分离法操作简便，但比较适宜于分离预培养中出现的优势种类和受少量生物污染培养液中的藻类；稀释分离法操作简单易行，但有一定程度盲目性；水滴分离法和稀释法要真正到达分离纯化的时间比较长；琼脂平板法包括涂布、划线和喷雾三种方式。这方法操作简单，适用于大部分藻种的分离，且效果最好，容易得到单一的纯种藻落，是微藻分离的优选方法。然而，这种方法仍存不足。其一，如：涂布法，涂布棒反复涂布均匀细胞时直接对藻细胞产生机械损伤，在这个过程中，一些细胞数量少、相对脆弱的细胞因受损而不容易分离得到；其二，固体平板分离微藻一般选择一种或者数种培养基，适宜该培养基的微藻快速生长起来，成为优势种，然而有些不适宜该培养基或者“停滞期”较长的微藻需要经过比较长时间的适应才能进行细胞分裂增殖，在培养过程中，培养皿平板中的水分蒸发，盐度改变、琼脂平板的湿度逐渐降低，导致具有上述特性的这部分微藻细胞将很可能无法长成藻落。因此，采用目前这些技术方法，仍然有相当一部分微藻种质资源无法获得，许多优质藻种未能为人所知。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有分离技术方法存在的不足，提供一种分离效果更为理想的高效分离微藻种质资源的方法，从而提高微藻种质资源分离效率。本专利技术的高效分离微藻种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待分离样品均匀地滴或喷在琼脂培养基“槽纹”平板上，并使样品流进平板的“槽纹”中，将培养皿封口进行培养，若上述“槽纹”平板中出现绿色、蓝色、褐色或紫色的单藻落，即为待分离样品中的微藻种类，挑出单藻落进行进一步的纯化，即可获得纯化的微藻藻种；所述的琼脂培养基“槽纹”平板是指在琼脂培养基上具有许多的“槽纹”。所述的将培养皿封口进行培养是在温度15-40℃，光强10-40μmol m-2s-1条件下培养5-20天。所述的琼脂培养基“槽纹”平板优选通过以下方法制备：琼脂培养基经高压灭菌后，冷却到40～60℃，倒入培养皿待凝固后，在琼脂培养基上方放置一张稍小于培养皿的带网眼的材料，继续倒入培养基，将带网眼的材料完全覆盖，待培养基完全凝固后取下带网眼的材料，固体培养基上留下“槽纹”，即得琼脂培养基“槽纹”平板。所述的带网眼的材料优选为带网眼的布料、面料或不锈钢材料。进一步优选为筛绢。所述的琼脂培养基为加入琼脂的海水微藻培养基或淡水微藻培养基，根据所采集的待分离样品而定，如样品是淡水来源的，则用淡水微藻培养基，如果样品是海水来源的，则用海水微藻培养基，这属于本领域的常规知识。所述的待分离样品为野外采集的水样、土壤样、受污染的微藻培养液、经过预培养的水样或土壤样，经过稀释或者浓缩到合适的浓度后作为待分离样品。所述筛绢为有网眼的面料。所述的挑出单藻落进行进一步的纯化优选是将挑出单藻落作为待分离样品，经培养基稀释后，均匀地滴或喷在琼脂培养基“槽纹”平板上，并使样品流进平板的“槽纹”中，将培养皿封口，倒置在温度15-40℃，光强10-40μmol m-2s-1条件下培养5-20天，出现单藻落，挑出单藻落，重复上述纯化步骤若干次，即可获得纯化的微藻藻种。本专利技术相对于现有技术方法，具有如下的优点：本专利技术仅通过简单的琼脂培养基“槽纹”平板，实现高效分离微藻种质资源的目的。“槽纹”平板接种避免涂布造成的细胞损伤，“槽纹”又能较长时间地为藻细胞提供相对稳定的“微环境”，有利于细胞稳定分裂增殖，在短时间内获得纯化微藻种质，容易获得采用一般分离方法难以获得的微藻种质。该方法适宜用于分离各种个体的微藻；对操作和设备要求低；分离时间短；实用性强。附图说明图1为本专利技术的琼脂培养基“槽纹”平板上的“槽纹”；图2为常规的普通平板和琼脂培养基“槽纹”平板分离淡水微藻藻种的效果比较；图3为常规的普通平板和琼脂培养基“槽纹”平板分离海水微藻藻种的效果比较。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：琼脂培养基“槽纹”平板的制备：BG11琼脂培养基(即在BG11培养基中加入常量的琼脂，如质量分数1.5～2％的琼脂)经高压灭菌后，冷却到55～60℃，在9cm的培养皿中加入12ml BG11琼脂培养基，待凝固后，在BG11琼脂培养基上方放置一张平整的直径稍微小于培养皿的400目尼龙筛绢，然后继续倒入5ml培养基，待BG11琼脂培养基完全凝固用镊子轻轻将筛绢取下，BG11琼脂培养基上留下筛绢条纹，即得BG11琼脂培养基“槽纹”平板，“槽纹”如图1所示。样品采自广州海珠区滨江西路珠江边的亲水平台，用经过灭菌的50ml离心管取亲水平台底部的水样，盖紧盖子，密封后带回实验室置于弱光，27℃保存。取10ml样品进行离心(4000g×，3min)，去掉上清，加入新鲜的BG11培养基，稀释到适中的细胞浓度作为待分离样品，取100μl待分离样品均匀滴到BG11琼脂培养基“槽纹”平板上，轻轻的左右前后倾斜平板，让样品流进平板的“槽纹”中，然后再用涂布棒将高于琼脂平板的样品液体推进“本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效分离微藻种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待分离样品均匀地滴或喷在琼脂培养基“槽纹”平板上，并使样品流进平板的“槽纹”中，将培养皿封口进行培养，若上述“槽纹”平板中出现绿色、蓝色、褐色或紫色的单藻落，即为待分离样品中的微藻种类，挑出单藻落进行进一步的纯化，即可获得纯化的微藻藻种；所述的琼脂培养基“槽纹”平板是指在琼脂培养基上具有许多的“槽纹”。

【技术特征摘要】
1.一种高效分离微藻种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待分离样品均匀地滴或喷在琼脂培养基“槽纹”平板上，并使样品流进平板的“槽纹”中，
将培养皿封口进行培养，若上述“槽纹”平板中出现绿色、蓝色、褐色或紫色的单藻落，即为
待分离样品中的微藻种类，挑出单藻落进行进一步的纯化，即可获得纯化的微藻藻种；
所述的琼脂培养基“槽纹”平板是指在琼脂培养基上具有许多的“槽纹”。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将培养皿封口进行培养是在温度
15-40℃，光强10-40μmol m-2s-1条件下培养5-20天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的琼脂培养基“槽纹”平板是通过以下
方法制备：琼脂培养基经高压灭菌后，冷却到40～60℃，倒入培养皿待凝固后，在琼脂
培养基上方放置一张...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴华莲，向文洲，李涛，王广华，戴世鲲，何慧，范洁伟，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44