一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法。本发明专利技术采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、生物素和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明专利技术采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。而且本发明专利技术制备得到的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗。

Preparation method of a bird flu virus, avian adenovirus two inactivated vaccine

The invention belongs to the field of veterinary biological products, in particular to a bird flu virus H9 subtype avian adenovirus type 4 two inactivated vaccine preparation method. The invention adopts LMH cell line as the carrier cells for virus proliferation by glutamine, recombinant human insulin, human serum albumin, transferrin, biotin and A culture medium composed of growth factors were cultured, collect virus liquid inactivated vaccine was prepared. The invention adopts the LMH cell line of H9 subtype of avian influenza virus and avian adenovirus type 4 proliferation without adding additional trypsin, and LMH cells with clear background, no exogenous pathogens, easy proliferation, can simplify the process and reduce the cost effectively. The content of virus and avian influenza virus, avian adenovirus prepared by the invention of the two combined inactivated vaccine, high stability, high safety, and is a kind of ideal avian influenza virus, avian adenovirus two vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，但发病率高，其主要临床表现为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。而且，该H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物，包括人，即有机会在人类中大规模流行，给人类健康带来严重的威胁。禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，临床上常常出现包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20-40天龄鸡只出现30％以上的死亡率。此外，其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。而且该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。因此，目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。虽然H9亚型禽流感和禽I群腺病毒灭活疫苗已广泛应用，该病也得到了有效控制，但是近几年来H9亚型禽流感和禽腺病毒4型感染在免疫鸡群中时有发生。为此，通过高适应载体表达高质量的有效抗原同时减少原有的生产成本达到针对同源/非同源H9亚型AIV、禽腺病毒4型流行株提供免疫保护的疫苗尤为必要。目前，我国的禽流感H9亚型和禽I群腺病毒主要是通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒而获得，专利文献CN105582533A公开了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗，该疫苗的制备的将将禽流感病毒、禽腺病毒经卵黄囊途径接种于SPF鸡胚进行病毒增殖，制备得到的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。但是采用SPF鸡胚载体进行病毒增殖，病毒滴度不高且用SPF鸡胚载体大规模生产其生产成本非常昂贵，不利于大规模生产。同时，通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒会出现如大流行时疫苗的供给量往往受到SPF鸡胚数量的限制；有些毒株无法在鸡胚中复制，因此难以获得足够量的病毒，只有鸡胚适应株才能获得高产量病毒；受体结合特异位点的变异导致抗原性降低；疫苗生产下游技术一成不变且十分繁重、易于污染等等，大大的限制了禽流感H9亚型和禽I群腺病毒疫苗的推广和应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中的缺陷，本专利技术提供一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法。本专利技术是采用动物传代细胞LMH细胞进行病毒增殖，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，血凝价高，免疫原性好的优点。本专利技术提供了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000-2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30-60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm条件下离心8～12min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，40～50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000-16000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。进一步地，所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1500单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm的条件下离心10min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取94份白油，2份硬脂酸铝，4份司班-80，将白油加热到78℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取48份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，48份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入4份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺1～4mmol/L、重组人胰岛素4～10μg/mL、人血清白蛋白1～3mg/mL、转铁蛋白2～6μg/mL、生物素2～4μg/mL和生长因子8～22mmol/L。进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子14mmol/L。进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比(4～6):(1～3)组成。进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班‑80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班‑80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，40～50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐温‑80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000～16000rpm的条件下乳化4‑6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，40～50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000～16000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。2.如权利要求1所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和15000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:100接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，严悌昆，谢秉超，敖艳华，
申请(专利权)人：广州博恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44