多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用制造技术

本发明专利技术属于烟草制备技术领域，具体涉及一种多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。本申请通过将特定菌株发酵获得粗酶液，然后将果胶酶固定在多孔陶瓷上，直接用于烟草薄片三级萃取液处理以降低其果胶酶含量，从而改善烟草品质。实验证明，本申请中固定化果胶酶用于烟草薄片加工过程中后，最高可将烟草薄片中果胶含量由2.00%降低到1.53%，降解率达到23.50%。将处理后烟草薄片用于卷烟后，感官抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟香气更加细腻，烟气透发性更好，刺激性减轻，口感发涩程度减小，杂气减少，劲头足，且燃烧性更好，能够改善烟草的吸食品质。

Immobilization of pectinase with porous ceramic and its application in the processing of tobacco slice

The invention belongs to the technical field of tobacco preparation, in particular to a porous ceramic immobilized pectinase and its application in the processing of tobacco slice. This application will get through specific fermentation crude enzyme solution, and then the pectinase was immobilized on porous ceramic, directly for the three stage extraction treatment liquid tobacco sheet to reduce the pectinase content, so as to improve the quality of tobacco. The experiment proved that the application of immobilized pectinase in the process of tobacco slice could reduce the pectin content from 2% to 1.53%, and the degradation rate was 23.50%. The processed tobacco sheet for cigarette, showed that the sensory evaluation of suction, add a cigarette samples after enzymolysis of tobacco sheet compared to the untreated sample, the cigarette smell is more delicate, more smoke through the hair, irritation, astringent taste reduced, miscellaneous gas reduction, full strength, and the combustion of better. To improve the smoking quality of tobacco.

【技术实现步骤摘要】
多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用
本专利技术属于烟草制备
，具体涉及一种多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。
技术介绍
造纸法烟草薄片（Paper-ProcessReconstitutedTobacco）是一种烟草资源再生利用的产品。它是利用一些烟草废弃料、边角料，如烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，经过浸提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香工艺过程，制成烟叶薄片，用作卷烟填充物。造纸法烟草薄片，不仅在改善烟叶产品结构强度、燃烧性能及降低卷烟的烟气烟碱和焦油量等方面具有优势，同时还能降低烟叶单耗，节约生产成本，可以说是烟草工业近年最重要的成果之一。而近年来，生物技术与造纸法烟草薄片技术在生产中的结合应用，不仅发挥了造纸法烟草薄片的工艺优势，而且利用生物技术有选择地改变烟草化学成分，明显改善了烟草薄片的品质。研究表明，烟草原料中的纤维素、木质素、果胶和蛋白质在高温下均会产生芳烃类化合物。其中果胶是一种胶体性物质，沉积在初生细胞壁和胞间层，并与纤维素、半纤维素、木质素以及一些蛋白质相互交联。果胶在热解过程中主要生成甲醇等有害物质。果胶的去除不仅能够减少这类物质的生成，而且还能够改变烟草细胞结构，让细胞变的更松散透气，有利于提高烟草燃烧能力，减少热解的发生。现有技术中，针对烟草薄片中果胶类物质的降解主要是采用传统的果胶酶进行的。但是由于烟草薄片中果胶结构的复杂性和多样性，而现有技术中的果胶酶普遍存在对于烟草薄片中果胶降解针对性不强、降解不够充分、降解过程难以控制的缺陷，因而急需探讨新的果胶酶及其在烟草薄片加工中的应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种利用特定菌株发酵制备的果胶酶，通过将该果胶酶固定化在多孔陶瓷上，对烟草薄片加工过程中的三级萃取液具有较好针对性，可实现针对性降解，从而改善烟草品质。本专利技术的技术方案具体如下所述。一种多孔陶瓷固定化果胶酶，以多孔陶瓷为载体固定化果胶酶，通过如下生产步骤制备获得：（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中28~32℃活化培养2~3d左右；所述发酵菌株具体为中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为CICC41151的塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)；该菌株为可公开获得菌株；所述活化培养基为查氏琼脂培养基；从保藏培养基挑取菌株后接种活化培养基时具体可采用划线法接种；（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养36~48h左右（优选，26℃、160r/min培养48h），制备种子液；所述种子培养基配方为：果胶3g/L，蛋白胨10g/L，NaNO33.0g，MgSO4•7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4•4H2O0.01g，K2HPO41.0g，pH=6.0～6.5；具体装液量可设计为：100/250mL锥形瓶。（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养4~14h以进一步发酵培养（优选，26℃、160r/min摇床培养12h左右）；将种子液接种发酵培养基时，接种量具体可按4%体积分数比例进行接种；所述发酵培养基配方为：果胶50g/L、蛋白胨2.0g/L，pH=6.2左右；（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液，测定酶活后即可作为果胶酶进行固定；（5）果胶酶的固定化，将步骤（4）中的果胶酶，以直径0.4cm、平均孔径650～750nm的多孔陶瓷为载体，将果胶酶固定化3~5h（优选固定化4h）后，以质量浓度1.2~1.6%的戊二醛交联1~3h（优选以质量浓度1.3%的戊二醛交联2h）。所述多孔陶瓷固定化果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，用于烟草薄片原料的烟梗和烟末进行逆流萃取加工过程中的三级萃取液，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。较优处理条件为，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：40mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，45℃、酶解3h。一种利用所述多孔陶瓷固定化果胶酶的针对烟草薄片中果胶的加工方法，具体包括如下步骤：（1）制备多孔陶瓷固定化果胶酶，按照上述步骤（1）至步骤（5）方法制备多孔陶瓷固定化果胶酶备用；（2）按照现有烟草薄片加工工艺，在烟草薄片原料的烟梗和烟末进行逆流萃取加工过程中的三级萃取液中，加入步骤（1）中所制备多孔陶瓷固定化果胶酶，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。本专利技术的总体技术路线是：将特定菌株首先发酵，筛选优化最佳发酵条件，获得最高果胶酶酶活的粗酶液，然后将果胶酶固定在多孔陶瓷上，直接用于烟草薄片三级萃取液处理以降低其果胶酶含量，通过优化处理工艺，获得最佳降解效果，从而改善烟草品质。初步试验表明，可将烟草薄片三级萃取液中果胶含量由2.00%降低到1.53%，降解率达到23.50%。将处理后烟草薄片用于卷烟后，进一步的感官抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟香气更加细腻，烟气透发性更好，刺激性减轻，口感发涩程度减小，杂气减少，劲头足，且燃烧性更好，从而较好的改善了烟草的吸食品质。总体而言，本申请与现有烟草薄片加工工艺结合较为紧密，所制备多孔陶瓷固定化果胶酶酶活较高，便于应用，能够较好降解烟草薄片原料中果胶成分，改善烟草质量效果较为明显，具有一定地推广应用价值。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中果胶含量测定、果胶降解率的计算方法简要介绍如下。酶活测定方法本专利技术中酶活测定参照Miller(1959)方法，具体为：A．取0.4mLl%果胶溶液于试管中，加入1.0mLpH=5的0.04mol/LNa2HPO4-0.02mol/L柠檬酸缓冲液，45℃水浴平衡5min；B．加入0.1mL适当稀释的酶液，45℃反应30min（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）；C．加入3.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴5min；D．冷却，定容至15mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度，得到反应体系中半乳糖醛酸的量；酶活力单位：1mL酶液或1g酶在45℃、pH5.0的条件下，每min分解底物产生lμg半乳糖醛酸的酶量定义为1单位聚半乳糖醛酸酶(PG)酶活，以U/mL表示；酶活力计算公式：U=(C实验-C对照)*N*1000*(V总/V酶)/t；其中，N—酶液稀释倍数，V总—反应总体积，V酶—酶液体积，t—反应时间（min）；DNS法标准曲线的绘制：配置1mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液。取1mg/mL半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，补水至1mL，加DNS试剂3mL，混合后于沸水中煮7min，冷却后定容至15mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度；以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线。果胶含量测定下述实施例中对于烟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多孔陶瓷固定化果胶酶，在其特征在于，通过如下步骤制备获得：（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养2~3d；所述发酵菌株具体为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC 41151的塔宾曲霉；（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养36~48h，制备种子液；（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养4~14h进一步发酵培养，获得发酵液；所述发酵培养基配方为：果胶50 g/L、蛋白胨2.0g/L，pH=6.2；（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液；（5）果胶酶的固定化，将步骤（4）中的粗酶液，以多孔陶瓷为载体进行果胶酶固化，再进行戊二醛交联化，以固定果胶酶。

【技术特征摘要】
1.一种多孔陶瓷固定化果胶酶，在其特征在于，通过如下步骤制备获得：（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养2~3d；所述发酵菌株具体为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC41151的塔宾曲霉；（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养36~48h，制备种子液；（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养4~14h进一步发酵培养，获得发酵液；所述发酵培养基配方为：果胶50g/L、蛋白胨2.0g/L，pH=6.2；（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液；（5）果胶酶的固定化，将步骤（4）中的粗酶液，以多孔陶瓷为载体进行果胶酶固化，再进行戊二醛交联化，以固定果胶酶。2.如权利要求1所述多孔陶瓷固定化果胶酶，其特征在于，步骤（2）中，所述种子培养基配方为：果胶3g/L，蛋白胨10g/L，NaNO33.0g，MgSO4•7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4•4H2O0.01g，K2HPO41.0g。3.如权利要求1所述多孔陶瓷固定化果胶酶，其特征在于，步骤（5）中...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝辉，马宇平，许春平，陈芝飞，邱建华，刘绍锋，张俊岭，李怀奇，蔡莉莉，董艳娟，王充，冉盼盼，
申请(专利权)人：河南中烟工业有限责任公司，郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南,41