一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE的设计、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE的设计、制备方法和应用，多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE的活性成分是一条多肽，主要由多房棘球蚴多表位肽AE以及黏膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热毒素B亚基(LTB)构成。本发明专利技术主要通过基因合成技术合成多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE基因序列，通过双酶切连接至表达载体中，然后将表达载体转化进Arctic Express进行融合蛋白的表达。蛋白纯化后，获得多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE。该多房棘球蚴多表位疫苗能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。

A kind of Echinococcus multilocularis multi epitope LTB vaccine design, AE preparation method and Application

The invention relates to a kind of Echinococcus multilocularis multi epitope LTB vaccine design, AE preparation method and application of active ingredients of Echinococcus multilocularis multi epitope LTB vaccine AE is a polypeptide composed mainly of Echinococcus multilocularis multi epitope peptide AE and mucosal immune adjuvant of Escherichia coli heat labile toxin B subunit (LTB) a. The invention mainly by gene synthesis of Echinococcus multilocularis multi epitope LTB vaccine AE gene sequence by double enzyme digestion connected to the expression vector, and then transformed into the expression vector Arctic Express fusion protein. The purified protein, obtain Echinococcus multilocularis multi epitope LTB vaccine AE. The real Echinococcus multi epitope vaccine can induce the real T cell and B cell immune response and high titer of Echinococcus antibody specific humoral immune response, can be used for the prevention and treatment of diseases associated with infection of Echinococcus multilocularis.

【技术实现步骤摘要】
一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的设计、制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种多房棘球蚴疫苗的设计、制备方法和相关应用。
技术介绍
包虫病(echinococcosis)是一种人畜共患型寄生虫疾病，又称棘球蚴病,包括由细粒棘球绦虫引起的幼虫病：单房/细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,CE)和多房棘球绦虫引起的幼虫病：多房棘球蚴病（alveolarechinocococosis,AE）。多房棘球蚴在中间宿主肝内以出芽的方式生长或浸润式增殖，产生新囊泡，长入肝组织，囊壁外角皮层很薄且常不完整，囊体与周围组织间无明显界限，囊液持续渗漏可与肝组织接触，引起局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死，晚期似肝癌样转移能转移至肺、脑、乳腺等脏器，临床有“虫癌”之称，预后极差。青海省是多房棘球蚴病的高发区，已被列为重点防治寄生虫病之一。多房棘球蚴病具有发病范围广、恶性程度高、预后效果差的特点。在高原地域，大多数牧区患者出现症状时就医往往已是晚期，不能手术切除，即使进行肝部分或半叶切除，术后复发率也很高。甲苯达唑、阿苯达唑等抗生素疗法有一定的治疗效果，但是由于需长期连续治疗导致该疗法具有耐药性的出现及治疗后复发率高等缺限。表位疫苗具免疫特异性高、稳定、无毒、分子结构小而简单等优势，并且表位疫苗可通过组合不同的Th1、Th2及B细胞表位可有效防止免疫逃避现象的发生，故已被应用于抗细菌、病毒等感染与抗肿瘤中。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下优点：（1）表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。（2）抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3）表位疫苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。（4）表位疫苗具有十分灵活的设计性，可组合不同Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。（5）表位疫苗选用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。研究发现Emy162具有很强的免疫作用，并稳定表达于棘球蚴生命周期的各阶段（原头节、培养的棘球蚴、未成熟成虫与成熟成虫），在棘球蚴的粘附及运动生理学中发挥重要的作用。SugimotoC发现多房棘球蚴表面抗原TSP3具有良好的免疫原性；但是OkuY等人在最新的研究中发现TSP3以及TSP3融合FBP在免疫老鼠的后期发生Th1型向Th2型的免疫类型的转变，导致多房棘球蚴免疫逃逸的发生，抑制率仅为60%，因此以Emy162制备多房棘球蚴亚单位基因工程疫苗，存在不易表达、提取、纯化等问题。故传统药物及疫苗在预防和治疗包虫病在临床应用中的效果确实不尽如人意。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种针对多房棘球蚴的多表位疫苗。本专利技术的第二个目的在于提供一种多房棘球蚴多表位疫苗的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供多房棘球蚴多表位疫苗的用途。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，该多房棘球蚴多表位疫苗主要由大肠杆菌不耐热性肠毒素（LTB）和Emy162、TSP3的T细胞表位和B细胞表位构成，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的整体氨基酸序列如序列1所示，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的核苷酸序列如序列2所示；多表位肽AE的氨基酸序列如序列3所示；多房棘球蚴多表位肽AE的核苷酸序列如序列4所示。所述多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE包含核苷酸序列的表达载体、转基因细胞系及宿主菌；大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）和多房棘球蚴多表位肽AE之间的间隔序列为DPRVPSS。所述多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE具有以下优点：（1）多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE将Emy162及TSP3的优势抗原表位和黏膜免疫佐剂LTB科学合理地整合在一起，可激发针对多房棘球蚴抗原Emy162及TSP3的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。（2）TSP3是多房棘球蚴表面抗原，被公认为是多房棘球蚴疫苗的理想候选抗原能够取得良好的保护作用；Emy162蛋白表达在多房棘球蚴的多个时期，是良好的候选抗原。（3）由于以Emy162制备多房棘球蚴亚单位基因工程疫苗，存在不易表达、提取、纯化等问题，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE含有这4种Emy162及TSP3的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提取及纯化。（4）LTB-AE抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，而所述多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE采取“偶联分子内免疫佐剂”的设计思路来增强表面抗原AE的免疫原性，从而诱发高滴度的特异性抗体产生。本专利技术的第二个目的是提供所述多房棘球蚴多表位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：（1）新型多房棘球蚴多表位疫苗抗原分子的结构设计根据机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制，合理选择多房棘球蚴抗原蛋白Emy162和TSP3的Th、B细胞优势抗原表位，通过生物信息学对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，并与黏膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热性肠毒素（LTB）相偶联设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE。（2）重组表达质粒pCzn1-LTB-AE（含有融合基因LTB-AE）的构建采用基于PAS(PCR-basedAccurateSynthesis)的方法合成基因LTB-AE，通过双酶切连接至pCzn1载体的NdeI和XbaI之间，获得的重组质粒pCzn1-LTB-AE。（3）融合蛋白LTB-AE的原核表达及纯化将重组表达载体pCzn1-LTB-AE转化进大肠杆菌ArcticExpress中，构建重组基因工程菌株ArcticExpress/pCzn1-LTB-AE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-IDA镍离子亲和层析获得电泳纯度的融合蛋白LTB-AE，即为多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE。本专利技术的第三个目的是提供多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的用途。多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。本专利技术以大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）作为分子内佐剂。大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）是由产肠毒素大肠杆菌（enteroxigenicEscherichiacoli,ETEC）分泌的一种外毒素。LT是大肠杆菌质粒的编码产物，天然状态下分泌于大肠杆菌质周腔。已有报道显示，LTB具有复杂的免疫调节功能，是很强的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂，是开发粘膜免疫佐剂的研究热点对象，LTB还具有免疫调节作用，用于某些自身免疫病的防治研究。本专利技术通过采用分子克隆技术通过对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数的分析设计泡型包虫多表位疫苗，并经原核系统表达并纯化获得重组蛋白LTB-AE；继而将多表位疫苗LTB-AE免疫小鼠后经Elisa、小鼠脾淋巴细胞增殖实验、GM1特异性Elisa等技术考察多表位疫苗LTB-AE的免疫原性及生物活性。确认该多房棘球蚴多表位疫苗能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。附图说明图1：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的分子结构设计特点；图2：重组表达载体pCzn1-LTB-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE，其活性成分是一条多肽，主要由大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）和多房棘球蚴多表位肽AE构成，其氨基酸序列如序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，其活性成分是一条多肽，主要由大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）和多房棘球蚴多表位肽AE构成，其氨基酸序列如序列1所示。2.如权利要求1所述的多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，其核苷酸序列如序列2所示。3.如权利要求1所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，多房棘球蚴多表位肽AE主要由Emy162和TSP3的优势Th和B细胞抗原表位的多拷贝体构成，其氨基酸序列如序列3所示。4.如权利要求3所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，多房棘球蚴多表位肽AE的核苷酸序列如序列4所示。5.如权利要求2或4所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，包含所述的核苷酸序列的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。6.如权利要求1所述的多房棘...

【专利技术属性】
技术研发人员：格日力，汤锋，李润乐，樊海宁，刘川川，冯琳，刘文磊，杨宝良，杨全余，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海,63