磁分离‑信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法技术

本发明专利技术公开了一种磁分离‑信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法。采用氯霉素适配体修饰磁性纳米粒子用于结合样品中氯霉素，通过磁分离操作实现了快捷分离和富集；在金电极表面修饰一段与氯霉素适配体序列部分互补的捕获探针，用于结合未被氯霉素占据的适配体位点，实现磁性纳米粒子的标记；最后，采用电化学方法转化磁性纳米粒子标记物为具有电化学活性的普鲁士蓝，根据其电化学还原峰电流获得与氯霉素浓度成反比的输出信号。本发明专利技术实现磁分离富集和信号放大的一体化，节约时间和试剂成本，简化检测步骤和实验仪器使用过程，快速、低成本、可操作强，实现对氯霉素的灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法
本专利技术涉及用于抗生素检测的生物传感器
，特别是一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法。
技术介绍
抗生素对细菌和微生物具有抑制和杀灭作用，被广泛应用于农业、畜牧业、生物科学和食品工程等领域。氯霉素是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生素，成本低廉，抑菌效果好，是当前用量最大的抗生素之一。然而，氯霉素可在动物体内大量残留，屡屡导致严重的食品安全事件，给人类健康带来了极大威胁，备受社会和政府关注。因此，开发可靠、简便的氯霉素检测方法至关重要。在生物传感器领域，为实现目标物的灵敏检测，通常需要分离和富集目标物以及放大检测信号。对于目标物分离和富集，修饰有生物分子的磁性纳米粒子已成为最有效的分离富集工具之一。对于信号放大，采用纳米粒子是当前最有效方法之一。然而，磁性纳米粒子行使分离和富集功能后一般不参与信号输出，导致需要引入额外的信号标记物，从而增加成本和干扰因素，使检测步骤繁琐。
技术实现思路
本专利技术针对目前现有技术的不足，提供一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法，实现磁分离富集和信号放大的一体化，籍此开发新型生物传感方法用于检测氯霉素，降低成本，简化步骤，提高灵敏度和可靠性。本专利技术中，采用氯霉素适配体修饰磁性纳米粒子用于结合样品中氯霉素，通过磁分离操作实现了快捷分离和富集；在金电极表面修饰一段与氯霉素适配体序列部分互补的捕获探针，用于结合未被氯霉素占据的适配体位点，实现磁性纳米粒子的标记；最后，采用电化学方法转化磁性纳米粒子标记物为具有电化学活性的普鲁士蓝，根据其电化学还原峰电流获得与氯霉素浓度成反比的输出信号。如图1所示，本专利技术的技术方案如下：本专利技术包括三电极电化学系统，三电极电化学系统以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，三电极电化学系统以适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极为工作电极，三电极电化学系统工作后在工作电极上由磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝。并进一步由根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流，获得氯霉素浓度。所述适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极的具体制备过程和磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝过程如下：1)制备适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极；2)采用三电极电化学系统，在适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)上将磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝；3)根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流，获得氯霉素浓度。所述步骤1)中的适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极采用以下方式制备：1.1)通过共沉淀化学合成方法制备磁性纳米粒子水溶液(MNPs)；1.2)处理磁性纳米粒子水溶液制备适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)；1.3)处理金电极获得捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)；1.4)处理适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)和捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。所述步骤1.1)具体如下：1.1.1)FeCl3和FeSO4溶于pH3的盐酸稀释液中并持续充氮气20min以除去氧气，同时制备NaOH溶液并持续充氩气20min以除去氧气；所述FeCl3和FeSO4的物质的量之比为2:1，NaOH溶液物质的量浓度为1.25M。1.1.2)将上述步骤1.1.1)中已除去氧气的含有FeCl3和FeSO4的混合溶液与NaOH溶液迅速混合，持续搅拌，充氩气2h，得到四氧化三铁磁性纳米粒子溶液，再用去离子水和乙醇反复清洗后得到磁性纳米粒子水溶液(MNPs)。所述用去离子水和乙醇反复清洗具体是：a)磁分离，去除上清液，加入去离子水；b)磁分离，去除上清液，加入乙醇；c)重复上述步骤a)和b)反复多次。所述步骤1.2)具体如下：1.2.1)将磁性纳米粒子水溶液在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散10min，得到分散均匀的磁性纳米粒子分散液；1.2.2)将用于羧基化磁性纳米粒子的柠檬酸与磁性纳米粒子分散液混合，柠檬酸的加入量为0.1-0.4mol每克磁性纳米粒子，置于摇床上反应12h过夜得到羧基化磁性纳米粒子分散液(MNPs-COOH)；1.2.3)将羧基化磁性纳米粒子分散液依次进行磁性分离和去除上清液，获得羧基化磁性纳米粒子，然后将羧基化磁性纳米粒子用磷酸缓冲液(PH6.8)清洗3次，分散于MES缓冲液中，使得羧基化磁性纳米粒子的最终浓度约为10mgmL-1，4℃下保存，获得含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液；1.2.4)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)加入到1mL的含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液中，常温下搅拌反应2h，得到活化磁性纳米粒子溶液；将活化磁性纳米粒子溶液用PH6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次，然后分散在1mL磷酸缓冲液中，获得含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液；1.2.5)取含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液与氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液于常温下反应，用PH6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次，得到适配体修饰磁性纳米粒子，然后分散在1mL磷酸缓冲液中，4℃下保存，获得适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)。所述步骤1.2.4)中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)用量为10mmol每克磁性纳米粒子，N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)用量为15mmol每克磁性纳米粒子。所述步骤1.2.5)的氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液中，氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)序列如SEQIDNO.1：5′-NH2-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3′。所述步骤1.2.5)中氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)的物质的量浓度为0.6-1μM，优选浓度为0.8μM。所述步骤1.2.5)中的反应时间为45-90min。所述步骤1.3)具体如下：1.3.1)取干净金电极，将其置于3,3’—二硫代双磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯(DTSSP)水溶液中浸泡，去离子水清洗3次，获得DTSSP修饰金电极(DTSSP/Au)；1.3.2)滴加链霉亲和素(SA)溶液于DTSSP修饰金电极表面，常温下反应，反应后用pH7.0的PBS缓冲液清洗金电极表面，获得链霉亲和素修饰金电极(SA/DTSSP/Au)；1.3.3)滴加乙醇胺(ETA)溶液于链霉亲和素修饰金电极表面，常温下反应以封闭非特异性结合位点，反应后用PBS缓冲液(pH7.0)清洗金电极表面；1.3.4)滴加捕获探针DNA(ssDNA)溶液于经乙醇胺处理过的金电极表面，常温下反应，反应后用PBS缓冲液(pH7.0)清洗，获得捕获探针DNA修饰金电极(ssDNA/ETA/SA/DTSSP/Au，以下简称ssDNA/Au)。所述步骤1.3.1)中的干净金电极采取以下方式清洗获得：电极依次在砂纸、0.5μm和0.05μm直径的氧化铝粉末中打磨，再用去离子水、无水乙醇、去离子水超声交替清洗各5分钟，配置体积比为1:3的3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁分离‑信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器，包括三电极电化学系统，三电极电化学系统以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，其特征在于：三电极电化学系统以适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极为工作电极，三电极电化学系统工作后在工作电极上由磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝。

【技术特征摘要】
1.一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器，包括三电极电化学系统，三电极电化学系统以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，其特征在于：三电极电化学系统以适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极为工作电极，三电极电化学系统工作后在工作电极上由磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝。2.一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器的方法体系，其特征在于：所述适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极的具体制备过程和磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝过程如下：1)制备适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极；2)采用三电极电化学系统，在适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)上将磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝；3)根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流，获得氯霉素浓度。3.根据权利要求1所述的氯霉素检测生物传感器或者根据权利要求2所述的方法体系，其特征在于：所述适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极采用以下方式制备：1.1)通过共沉淀化学合成方法制备磁性纳米粒子水溶液(MNPs)；1.2)处理磁性纳米粒子水溶液制备适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)；1.3)处理金电极获得捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)；1.4)处理适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)和捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。4.根据权利要求3所述的氯霉素检测生物传感器或者方法体系，其特征在于：所述步骤1.1)具体如下：1.1.1)FeCl3和FeSO4溶于pH3的盐酸稀释液中并持续充氮气20min以除去氧气，同时制备NaOH溶液并持续充氩气20min以除去氧气；1.1.2)将上述步骤1.1.1)中已除去氧气的含有FeCl3和FeSO4的混合溶液与NaOH溶液迅速混合，持续搅拌，充氩气2h，得到四氧化三铁磁性纳米粒子溶液，再用去离子水和乙醇反复清洗后得到磁性纳米粒子水溶液(MNPs)。5.根据权利要求3所述的氯霉素检测生物传感器或者方法体系，其特征在于：所述步骤1.2)具体如下：1.2.1)将磁性纳米粒子水溶液在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散10min，得到分散均匀的磁性纳米粒子分散液；1.2.2)将柠檬酸与磁性纳米粒子分散液混合，柠檬酸的加入量为0.1-0.4mol每克磁性纳米粒子，置于摇床上反应12h过夜得到羧基化磁性纳米粒子分散液(MNPs-COOH)；1.2.3)将羧基化磁性纳米粒子分散液依次进行磁性分离和去除上清液，获得羧基化磁性纳米粒子，然后将羧基化磁性纳米粒子用磷酸缓冲液(PH6.8)清洗3次，分散于MES缓冲液中，使得羧基化磁性纳米粒子的最终浓度约为10mgmL-1，4℃下保存，获得含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液；1.2.4)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)加入到1mL的含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液中，常温下搅拌反应2h，得到活化磁性纳米粒子溶液；将活化磁性纳米粒子溶液用PH6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次，然后分散在1mL磷酸缓冲液中，获得含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液；1....

【专利技术属性】
技术研发人员：李延斌，傅迎春，曹露露，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33