一种赤霉烯酮分解酶及其编码基因和用途制造技术

本发明专利技术提供了一种赤霉烯酮分解酶及其编码基因，所述赤霉烯酮分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者所述赤霉烯酮分解酶是如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过修饰所得到的具有降解赤霉烯酮功能的蛋白衍生物。该酶可以完全分解赤霉烯酮。本发明专利技术表达的重组赤霉烯酮分解酶，可以对饲料中真菌毒素赤霉烯酮进行分解，对防治猪群霉菌毒素中毒起到有效作用。

【技术实现步骤摘要】
一种赤霉烯酮分解酶及其编码基因和用途
本专利技术属于生物
，具体涉及一种赤霉烯酮分解酶及其编码基因，以及该分解酶的应用。
技术介绍
赤霉烯酮(ZEN)是由禾谷镰刀菌产生的一种非甾体霉菌毒素，最初于1962年由Stob等从发霉的玉米中分离得到。1966年，Urry等利用经典化学，核磁共振及质谱分析等方法确定了该物质的化学结构，并称之为F-2毒素。其化学名称为：6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)-β-雷羧酸内酯。ZEN是全球污染范围最广的一类真菌毒素，污染范围包括小麦、玉米、高粱、燕麦等谷物及其制品，其中玉米中的ZEN检出率极高，严重影响粮食食品安全。ZEN很强的雌激素作用，主要作用部位为生殖系统，具有导致动物生殖障碍，流产、死胎等生殖毒性。此外还有肝脏毒性、免疫毒性和遗传毒性，导致动物繁殖功能紊乱。被ZEN污染的食品、饲料通过食物链在人和牲畜体中蓄积，进而威胁人和动物的健康，导致肝癌、食道癌和青春期早熟等疾病。目前，去除ZEN的方法主要包括物理法、化学法以及生物法，主要是通过破坏、修饰或吸附的方式作用于真菌毒素，从而达到削减或消除毒素的目的。物理法的毒素降解效果不太明显，化学法效果虽比物理法较佳，但可能造成营养成分丢失或化学试剂残留。生物法主要是基于微生物菌体对毒素的吸附作用，或利用微生物产生的胞内、胞外酶将ZEN降解成无毒或毒性较低的物质，生物法具有去毒效率高、反应条件温和不破坏营养等优点。采用高效、专一及环境友好的生物酶法进行绿色解毒，成为近年来国内外研究的新热点。目前已经发现包括细菌、真菌在内的多种微生物能够产生产赤霉烯酮分解酶，有效地分解ZEN。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种赤霉烯酮分解酶及其编码基因，该酶可以完全分解赤霉烯酮。为实现上述目的，所采取的技术方案：一种赤霉烯酮分解酶，所述赤霉烯酮分解酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；或者所述赤霉烯酮分解酶是如SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过修饰所得到的具有降解赤霉烯酮功能的蛋白衍生物。本专利技术所提供的赤霉烯酮分解酶被命名为ZEN-jlm，来源于粉红螺旋聚孢霉。本专利技术提供了上述所述的赤霉烯酮分解酶的编码基因。优选地，所述赤霉烯酮分解酶的的编码基因序列如SEQIDNO:1所示；或者所述赤霉烯酮分解酶的的编码基因是具有与SEQIDNO:1序列至少98％序列同一性且编码具有降解赤霉烯酮功能的蛋白质的DNA分子。本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体是将上述所述的编码基因连接到基础载体上而得的，用于表达上述所述的赤霉烯酮分解酶。优选地，所述基础载体为pHY300-PLK质粒。本专利技术提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述所述的表达载体，或其基因组中整合有上述所述的编码基因。优选地，所述宿主细胞是将权利要求4或5所述的表达载体转化枯草芽孢杆菌而得到的。本专利技术提供了一种上述所述表达载体表达的重组赤霉烯酮分解酶，或者培养上述所述的宿主细胞得到的重组赤霉烯酮分解酶。本专利技术提供了上述所述的赤霉烯酮分解酶、上述所述的重组赤霉烯酮分解酶在制备用于降解赤霉烯酮或者控制赤霉烯酮霉菌毒素污染的饲料添加剂或者饲料中的用途。本专利技术提供了一种用于降解赤霉烯酮或者控制赤霉烯酮霉菌毒素污染的饲料添加剂或者饲料，所述饲料添加剂或者饲料包括上述所述的赤霉烯酮分解酶、或者上述所述的重组赤霉烯酮分解酶。本专利技术的有益效果在于：本专利技术表达的重组赤霉烯酮分解酶，可以对饲料中真菌毒素赤霉烯酮进行分解，对防治猪群霉菌毒素中毒起到有效作用。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：赤霉烯酮分解酶基因(ZEN-jlm)的获得本专利技术人用TaKaRa公司SmartTMcDNA文库构建试剂盒，构建了粉红螺旋聚孢霉(Gliocladiumroseum)cDNA文库，通过随机挑取克隆测序，并将测得序列用BLAST与国际基因库(GenBank)中的序列进行比较，获得了赤霉烯酮分解酶(ZEN-jlm)的cDNA。1.粉红螺旋聚孢霉(Gliocladiumroseum)总RNA的提取将粉红螺旋聚孢霉在液体PDA培养基中培养(200转/分钟，30℃，48h)，培养完成后，12000r/min离心10min收集沉淀。DEPC处理水配制的75％乙醇溶液洗涤。室温干燥，RNase-free水溶解沉淀RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测可以见到清晰的28S和l8S两条带；以OD260/OD280比值鉴定总RNA的纯度，其比值为1.95；-80℃保存。2.第一链cDNA的合成(1)RNA的热变性：将以上成分混匀，在离心机上甩一下，于65℃孵育变性5min，立即放于冰上。(2)反应液配置：(3)逆转录反应：将反应液轻轻混匀，加1滴矿物油后进行如下操作：室温10min；42℃恒温1h；冰浴5min；合成cDNA第一链。瞬时离心后进行下一步操作或置于-20℃保存备用。3.LD-PCR合成双链cDNA以合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：将反应液轻轻混匀，在离心机上甩一下。加2滴矿物油，将反应管置于已预热至95℃的PCR仪上，进行LD-PCR。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸lmin，共循环30次；72℃延伸5min后结束反应。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电压4v/cm，电泳1h，凝胶成像仪下观察。4.LD-PCR产物的蛋白酶K消化50μL双链cDNA(2μg)，加入2μL蛋白酶K(20μg/μL)，45℃水浴20min，以消化样品中残存的酶类。加入50μL去离子水，100μL酚仿醇(酚：仿：醇＝50:49:1)14000r/min离心5min，取上层水相，向其中加入100μL氯仿和异戊醇的混合物14000r/min离心5min后，取上层水相并向其中加入10μL乙酸钠(3mol/L)，1.3μL糖原(20μg/μL)，2.5倍体积的95％乙醇，14000r/min下迅速离心20min，超净台中干燥沉淀。5.cDNA进行SfiⅠ酶切进行SfiⅠ(A，B)酶切，向上步骤中得到的沉淀中加入下列试剂：将反应液轻轻混匀，在离心机上甩一下，50℃保温2h。加入2μL二甲苯胺(1％)，轻轻混匀备用。6.cDNA分级分离按试剂盒使用说明操作，将100μLSfiⅠ(A，B)酶切过的双链cDNA和二甲苯胺的混合物，用CHROMASPIN-400柱分级分离，将分离后的cDNA片段大于300bp的收集管合并，并经进一步纯化后备用。7.cDNA片段和载体pDNR-LIB的连接双链cDNA片段与经相同的SfiⅠ(A，B)酶切的载体pDNR-LIB(1μL)的连接反应体积比分别采用0.5:1，1:1和1.5:1，以此来测试连接效率，将测试后余下的cDNA以最优化条件进行连接，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。重新纯化连接产物，以除去其中的离子，为电转化做准备。8.细菌DH5α感受态细胞的制备挑取平板上的DH5α单菌落接种于3mLLB培养液中，37℃过夜培养。取此培养液按1/100体积接种于新鲜的LB培养液中，37℃200r/min剧烈振荡培养至OD600为0.4左右。将锥形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种赤霉烯酮分解酶，其特征在于，所述赤霉烯酮分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或者所述赤霉烯酮分解酶是如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过修饰所得到的具有降解赤霉烯酮功能的蛋白衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种赤霉烯酮分解酶，其特征在于，所述赤霉烯酮分解酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；或者所述赤霉烯酮分解酶是如SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过修饰所得到的具有降解赤霉烯酮功能的蛋白衍生物。2.权利要求1所述的赤霉烯酮分解酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的赤霉烯酮分解酶的编码基因，其特征在于，所述赤霉烯酮分解酶的的编码基因序列如SEQIDNO:1所示；或者所述赤霉烯酮分解酶的的编码基因是具有与SEQIDNO:1序列至少98％序列同一性且编码具有降解赤霉烯酮功能的蛋白质的DNA分子。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体是将如权利要求2或3所述的编码基因连接到基础载体上而得的，用于表达如权利要求1所述的赤霉烯酮分解酶。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述基础载体为pHY300-PLK质粒。...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪猜，皮灿辉，刘耿霞，
申请(专利权)人：广州和仕康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44