一种改造小麦的方法技术

本发明专利技术公开了改造小麦的方法。该改造小麦的方法，包括如下步骤：抑制小麦中DEP1蛋白的表达和/或活性，进而实现小麦改造。本发明专利技术通过试验证明，利用基因组定点编辑技术同时突变小麦中DEP1基因的三个位点(即同时敲除TaDEP1‑A1基因、TaDEP1‑B1基因和TaDEP1‑D1基因)，得到了株型变矮小且光合作用增强的小麦。

Method for reforming wheat

The invention discloses a method for reforming wheat. The method for reforming wheat comprises the following steps: inhibiting the expression and / or activity of DEP1 protein in wheat, and realizing the transformation of wheat. The present invention is proved by the experiment, and three mutations in the DEP1 gene by using wheat genome editing technology (that is, at the same time point knockdown of TaDEP1 A1 gene, TaDEP1 gene and TaDEP1 B1 D1 gene), the plant became dwarf and Photosynthesis of wheat.

【技术实现步骤摘要】
一种改造小麦的方法
本专利技术涉及生物技术育种领域，具体涉及一种利用基因组编辑技术定点突变小麦相关基因对小麦进行改造的方法。
技术介绍
小麦起源于中东新月沃土(Levant)地区，是世界上重要的粮食作物之一，也是我国仅次于水稻的第二大农作物，其生产关系到世界和我国的粮食安全。小麦是一种温带长日照植物，适应范围较广，自北纬17°-50°，从平原到海拔约4000m的高原(如中国西藏)均有种植。全世界有43个国家，有35％-40％的人口以小麦为主要粮食。据联合国粮农组织2004年统计，全世界小麦收获面积32.36亿亩，单产193.8千克/亩，总产6.27亿吨。随着世界粮食生产形势日益严峻，进一步提高小麦TriticumaestivumL.,2n＝42,AABBDD)产量成为当前迫切需要解决的问题。小麦产量是由单位面积有效穗数、每穗粒数和千粒重构成的，实现三者的最佳协调关系，力争达到产量最大化，是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种改造小麦的方法。本专利技术所提供的改造小麦的方法，包括如下步骤：抑制小麦中DEP1蛋白的表达和/或活性，进而实现小麦改造。上述方法中，所述抑制DEP1蛋白表达的方法可以为使DEP1蛋白的编码基因功能降低或丧失。使DEP1蛋白的编码基因功能降低或丧失，可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失。使DEP1蛋白的编码基因功能降低或丧失具体可以采取化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑、同源重组等方法。无论采取哪种方法，既可对DEP1蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控DEP1基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将DEP1的编码基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子或第5外显子作为靶标。上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zincfingernuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociated,CRISPR/Cas9system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。上述各种基因定点突变技术，在操作中具体可按照如下步骤进行：在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶，在核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过小麦的自身DNA修复，完成对所述靶标片段的定点改造，进而实现使DEP1蛋白的编码基因功能降低或丧失。上述方法中，在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶的方法为：直接向小麦中导入核酸酶或向小麦中导入用于表达所述核酸酶的遗传物质。其中的遗传物质为DNA质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA。核酸酶指进行定点编辑的活性功能物质。上述在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶的方法中还可包括如下步骤：将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的小麦在无选择压力的情况下种植生长，所述核酸酶或未整合在小麦染色体上的所述遗传物质被细胞降解。在无选择压力情况下，植物自身的防御机制会抑制外源基因的进入并将已进入的外源基因降解。因而，将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的小麦进行种植生长，外源基因(包括用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的质粒或成套质粒上的任何片段)不会整合入小麦基因组中，最终获得的小麦为非转基因的定点改造小麦。当使用CRISPR/Cas9方法时，相应的，所述遗传物质为能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段；或所述遗传物质由能转录向导RNA的重组载体或DNA线性片段(或分别转录crRNA和tracrRNA的两个重组载体或DNA线性片段)，以及能表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；或所述遗传物质由向导RNA，以及能表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段。在所述重组载体中，启动所述向导RNA的编码核苷酸序列转录的启动子可为U3启动子或者U6启动子。当使用TALEN核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对TALEN蛋白的重组质粒，或同时表达成对TALEN蛋白的DNA线性片段；或同时表达成对TALEN蛋白的RNA；所述TALEN蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的DNA结合域和FokI结构域组成；当使用锌指核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对ZFN蛋白的重组质粒，或同时表达成对ZFN蛋白的DNA线性片段；或同时表达成对ZFN蛋白的RNA；所述ZFN蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的DNA结合域和FokI结构域组成。本专利技术的具体例子中采用了CRISPR/Cas9技术，其中涉及的靶序列为SEQIDNo.1，使用的向导RNA序列为SEQIDNo.2。进一步具体的，本专利技术中使用了如下(1)或(2)所示载体，当使用(1)所示载体时需与pJIT163-Ubi-rCas9载体联合使用，才能实现上述专利技术目的：(1)能转录向导RNA的重组载体，按照如下方法制备：将SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示片段进行退火，然后与经BbsI酶切的pTaU6-gRNA载体骨架相连，得到重组载体，记作pTaU6-gRNA-TaDEP1-1；(2)能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体，按照如下方法制备得到：以载体pTaU6-gRNA-TaDEP1-1为模板，用SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示引物对进行扩增，得到扩增产物；将扩增产物用SpeI进行酶切，酶切产物与经SpeI酶切的pJIT163-Ubi-rCas9载体骨架相连，得到重组载体。上述方法中，所述改造小麦可为增强小麦的光合作用能力、和/或增加小麦叶片叶绿素含量和/或改变小麦株型。其中的改变小麦株型具体可为使小麦株高变矮小。上述方法适用于任何小麦，只要含有上述靶序列即可，本专利技术列举的例子是普通小麦(TriticumaestivumL.)。由于小麦是多倍体植物，因此上述方法改造后得到的小麦可以是所有染色单体均被定点编辑的小麦，也可以是部分染色单体被定点编辑的小麦。本专利技术还提供了实现上述方法的一种工具，即用于改造小麦的试剂盒。本专利技术所提供的改造小麦的试剂盒，包括如下任一种：(1)sgRNA分子：其序列如SEQIDNo.2所示；(2)所述sgRNA的编码DNA分子；(3)表达所述sgRNA的载体；(4)能转录向导RNA的重组载体，按照如下方法制备：将SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示片段进行退火，然后与经BbsI酶切的pTaU6-gRNA载体骨架相连，得到重组载体，记作pTaU6-gRNA-TaDEP1-1；(5)能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体，按照如下方法制备得到：以载体pTaU6-gRNA-TaDEP1-1为模板，用SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造小麦的方法，包括如下步骤：抑制小麦中DEP1蛋白的表达和/或活性，进而实现小麦改造。

【技术特征摘要】
2016.01.29 CN 201610064340X1.一种改造小麦的方法，包括如下步骤：抑制小麦中DEP1蛋白的表达和/或活性，进而实现小麦改造。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制DEP1蛋白表达的方法为使DEP1蛋白的编码基因功能降低或丧失。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述使DEP1蛋白的编码基因功能降低或丧失的方法为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因组定点编辑为ZFN方法、TALEN方法或CRISPR/Cas9方法。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法中，靶标序列为SEQIDNo.1。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法中使用的gRNA的序列为SEQIDNo.2。7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法中使用了如下(1)或(2)所示载体：(1)能转录向导RNA的重组载体，按照如下方法制备：将SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示片段进行退火，然后与经BbsI酶切的pTaU6-gRNA载体骨架相连，得到重组载体，记作pTaU6-gRNA-TaDEP1-1；(2)能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体，按照如下方法制备：以载体pTaU6-gRNA-TaDEP1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高彩霞，宗媛，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11