一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法技术

本发明专利技术公开了一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法，该方法采用神经递质代谢类物标准品与稳定同位素标记试剂的衍生产物作为定量内标参照物，以液相色谱‑串联四极杆质谱为检测手段的神经递质类代谢物的全同位素衍生内标定量法。本发明专利技术能同时对多个神经递质代谢类物进行定性定量分析，具有样本制备简单、定性定量准确、高通量和花费低等优点，具有可预期的临床应用前景，本发明专利技术提供的方法弥补了当前该类神经递质代谢物测试定性定量准确度低、成本高以及仅能同时对几个物质进行分析等低通量缺点。

A total isotope internal standard mass spectrometry method for the quantification of neurotransmitter metabolites

The invention discloses a neurotransmitter metabolite the isotope internal standard mass spectrometry method, this method uses the derivatives of neurotransmitter metabolism. Standard and stable isotope labeling reagents as quantitative reference, neurotransmitter metabolites by liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry for detection means the whole isotope derivative internal standard method. The invention can simultaneously on multiple neurotransmitter metabolism of qualitative and quantitative analysis, with sample preparation is simple, accurate and quantitative high throughput and low cost, has clinical application prospect can be expected, the invention provides a method for the neurotransmitter metabolite test qualitative and quantitative low accuracy and high cost at the same time, only for several substances analyzed shortcomings of low flux.

【技术实现步骤摘要】
一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法
本专利技术涉及一种神经递质类代谢物质谱定量方法，进一步说是一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法。
技术介绍
神经递质是脑内维持各种生理功能的一类重要的生物活性分子。它们的含量变化与许多神经紊乱如抑郁、帕金森病、精神分裂症等疾病密切相关。这类物质代谢主要涉及色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路和儿茶酚胺通路等。定量研究这类物质的组成及其含量变化对于神经科学研究和临床诊断具有极其重要的意义。目前主要采用高效液相色谱-电化学检测方法对神经递质类物质检测，该方法仅能对少数几个浓度高的物质进行检测，且通量低和定性定量准确度差，因而限制了其临床应用和神经科学研究的深度。高效液相色谱-串联四极杆质谱联用技术因其特异性好、灵敏度高、定量准确和高通量等优点而逐渐被生命科学研究、药物研发和临床等应用，已成为定量检测的金标准。但是，神经递质类代谢物尤其是儿茶酚胺类代谢物因其高度亲水性和热不稳定性，在反相色谱柱上具有保留极差的缺点，在电喷雾离子化时常常发生源内降解，结果导致这些物质的色谱-质谱法检测难于检测或定量准确度非常差，且每次只能检测少数几个物质，与实际应用具有非常大的差距。最近，韩国科学家采用HMDS(hexamethyldisilazane)和MBHFBA(N-methyl-bis-heptafluorobutyramide)这两种衍生试剂分别对不同活性基团进行选择性衍生，并采用GC-MS/MS(MRM模式)行检测，成功地对该类物质进行定量检测，具有特异性好和灵敏度高(定量限在ng/mL水平)等优点(HongJ.Y.,J.Chromatogr.B2013,940:94-103)。但是繁琐的样本纯化步骤和衍生步骤，非常耗时。最近，科学家采用多种化学衍生法对该类物质的活性基团如氨基、羧基和酚羟基进行化学衍生，再行LC-MS/MS(MRM模式)法检测，有效地提高了待检测物的热稳定性、色谱保留和检测灵敏度。如中科院上海有机化学所采用DMMSP(4,6-dimethoxy-2-(methylsulfonyl)pyrimidine)对4个儿茶酚胺物质的酚羟基进行化学衍生，提高了热稳定性和检测灵敏度，但是存在衍生温度高达70℃且衍生反应结束后的衍生试剂清除复杂等缺点(高玉平等，中国化学学报，2010，28,1704-1708)。GrecoS等采用SPTPP(5-N-succinimidoxy-5-oxopentyl)triphenylphosphoniumbromide)对3个单胺类神经递质的活性基团氨基进行化学衍生和高选择性、高灵敏度和高通量分析(GrecoS.,AnalyticaChimicaActa2013,771:65-72)。以上两个衍生方法都存在仅能对一种活性基团进行衍生且无商业化可用的稳定性同位素衍生试剂等缺点。最近，我们采用一种常见的紫外衍生反应的苯甲酰氯反应试剂——苯甲酰氯及同位素标记的苯甲酰氯，可实现同时对活性基团如氨基、亚氨基和酚羟基进行衍生反应，有效地提高了神经递质类代谢物的热稳定性、色谱保留、检测灵敏度和定量准确性，实现同时对多个神经地质类代谢物的高灵敏度质谱检测定量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法，解决现有的对色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、儿茶酚胺通路等神经递质代谢相关的多个化合物检测定量存在灵敏度低和准确度不高的问题。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法，该方法采用神经递质类代谢物标准品与稳定同位素标记的苯甲酰氯的衍生产物作为定量内标参照物，对生物样本中神经递质类代谢物进行基于质谱技术平台的定性定量分析测试，包括以下具体步骤：(1)神经递质类代谢物标准品的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的制备：取神经递质类代谢物混合标准品母液两份，干燥，分别向两份干燥物中加入四硼酸钠缓冲液，然后分别加入非标记的苯甲酰氯和稳定性同位素标记的苯甲酰氯，进行酰化衍生反应，分别得到神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物，其中，同位素标记苯甲酰氯衍生产物的溶液作为内标母液，对该内标母液进一步稀释，获得基准内标溶液，用于标准曲线和生物样本的制备。(2)质谱定性定量方法的建立：采用流动注射法分别对神经递质类代谢物的非标记的苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记的苯甲酰氯衍生产物进行电喷雾离子化质谱检测参数优化,建立非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的多反应监测(MRM)条件；并将串联四极杆质谱与液相色谱仪联用，采用反相液相色谱柱对神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物进行色谱分离，确定各物质的色谱保留时间，建立神经递质类代谢物的定性、定量检测条件。(3)神经递质类代谢物定量标准曲线的制备：对步骤(1)获得的非标记苯甲酰氯衍生产物进行梯度稀释，并与步骤(1)获得的内标母液进行混合；采用步骤(2)中建立的质谱定性定量方法进行检测定量，以进样浓度为横坐标，以测得的各神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物与基准内标溶液中与之对应的稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的峰面积或峰高的丰度比值为纵坐标，建立定量标准曲线。(4)生物样本的制备、检测和定量：取生物样本，采用直接或经提取、干燥后再复溶后，加入四硼酸钠缓冲液和非标记的苯甲酰氯试剂，进行衍生反应，再加入基准内标溶液，涡旋震荡，上清液用于检测，检测方法为步骤(2)建立和优化的方法；分别计算各神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物及基准内标溶液中与之对应的稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的峰面积或峰高的丰度比值，代入定量标准曲线，计算得到样本中神经递质类代谢物的含量。本专利技术的进一步改进在于：步骤(1)中的神经递质类代谢物指天然或人工合成的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、儿茶酚胺通路中所有代谢物或代谢中间物。本专利技术的进一步改进在于：步骤(1)和(4)的加入四硼酸钠缓冲液，具体条件指四硼酸钠缓冲液的浓度为10-200mM，体积为生物样本体积或以毫克为单位的质量的0.5-20倍。本专利技术的进一步改进在于：步骤(4)中的非标记的苯甲酰氯试剂具体指为体积百分比0.1％至10％苯甲酰氯的乙腈溶液。本专利技术的进一步改进在于：步骤(1)和(2)中的稳定性同位素标记的苯甲酰氯是指碳13或氘原子标记的苯甲酰氯。本专利技术的进一步改进在于：碳13标记或氘原子标记的苯甲酰氯是指含有2-6个碳13或1-5个氘原子的苯甲酰氯。本专利技术的进一步改进在于：碳13或氘原子标记的苯甲酰氯具体为体积百分比0.1％至10％的乙腈溶液。本专利技术的进一步改进在于：步骤(1)和(4)的衍生反应，具体条件指温度为10-50℃，时间为5秒-5分钟。本专利技术的进一步改进在于：生物样本是指来自于人或动物的脑脊液、脊髓液、血浆、血清、脑组织匀浆、尿液、细胞、滤纸干血片中的任一种。本专利技术的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、儿茶酚胺通路化合物全同位素内标定量检测方法，是指对色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、儿茶酚胺通路化合物的串联质谱或者液相色谱-串联质谱联用分析中的内标采用色氨酸通路、γ-氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法，其特征在于，该方法采用神经递质类代谢物标准品与稳定同位素标记的苯甲酰氯的衍生产物作为定量内标参照物，对生物样本中神经递质类代谢物进行基于质谱技术平台的定性定量分析测试，包括以下具体步骤：(1)神经递质类代谢物标准品的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的制备：取神经递质类代谢物混合标准品母液两份，干燥，分别向两份干燥物中加入四硼酸钠缓冲液，然后分别加入非标记的苯甲酰氯和稳定性同位素标记的苯甲酰氯，进行酰化衍生反应，分别得到神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物，其中，同位素标记苯甲酰氯衍生产物的溶液作为内标母液，对该内标母液进一步稀释，获得基准内标溶液，用于标准曲线和生物样本的制备。(2)质谱定性定量方法的建立：采用流动注射法分别对神经递质类代谢物的非标记的苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记的苯甲酰氯衍生产物进行电喷雾离子化质谱检测参数优化,建立非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的多反应监测条件；并将串联四极杆质谱与液相色谱仪联用，采用反相液相色谱柱对神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物进行色谱分离，确定各物质的色谱保留时间，建立神经递质类代谢物的定性、定量检测条件。(3)神经递质类代谢物定量标准曲线的制备：对步骤(1)获得的非标记苯甲酰氯衍生产物进行梯度稀释，并与步骤(1)获得的内标母液进行混合；采用步骤(2)中建立的质谱定性定量方法进行检测定量，以进样浓度为横坐标，以测得的各神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物与基准内标溶液中与之对应的稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的峰面积或峰高的丰度比值为纵坐标，建立定量标准曲线。(4)生物样本的制备、检测和定量：取生物样本，采用直接或经提取、干燥后再复溶后，加入四硼酸钠缓冲液和非标记的苯甲酰氯试剂，进行衍生反应，再加入基准内标溶液，涡旋震荡，上清液用于检测，检测方法为步骤(2)建立和优化的方法；分别计算各神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物及基准内标溶液中与之对应的稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的峰面积或峰高的丰度比值，代入定量标准曲线，计算得到样本中神经递质类代谢物的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种神经递质类代谢物全同位素内标质谱定量方法，其特征在于，该方法采用神经递质类代谢物标准品与稳定同位素标记的苯甲酰氯的衍生产物作为定量内标参照物，对生物样本中神经递质类代谢物进行基于质谱技术平台的定性定量分析测试，包括以下具体步骤：(1)神经递质类代谢物标准品的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的制备：取神经递质类代谢物混合标准品母液两份，干燥，分别向两份干燥物中加入四硼酸钠缓冲液，然后分别加入非标记的苯甲酰氯和稳定性同位素标记的苯甲酰氯，进行酰化衍生反应，分别得到神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物，其中，同位素标记苯甲酰氯衍生产物的溶液作为内标母液，对该内标母液进一步稀释，获得基准内标溶液，用于标准曲线和生物样本的制备。(2)质谱定性定量方法的建立：采用流动注射法分别对神经递质类代谢物的非标记的苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记的苯甲酰氯衍生产物进行电喷雾离子化质谱检测参数优化,建立非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的多反应监测条件；并将串联四极杆质谱与液相色谱仪联用，采用反相液相色谱柱对神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物和稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物进行色谱分离，确定各物质的色谱保留时间，建立神经递质类代谢物的定性、定量检测条件。(3)神经递质类代谢物定量标准曲线的制备：对步骤(1)获得的非标记苯甲酰氯衍生产物进行梯度稀释，并与步骤(1)获得的内标母液进行混合；采用步骤(2)中建立的质谱定性定量方法进行检测定量，以进样浓度为横坐标，以测得的各神经递质类代谢物的非标记苯甲酰氯衍生产物与基准内标溶液中与之对应的稳定性同位素标记苯甲酰氯衍生产物的峰面积或峰高的丰度比值为纵坐标，建立定量标准曲线。(4)生物样本的制备、检测和定量：取生物样本，采用直接或经提取、干燥后再复溶后，加入四硼酸钠缓冲液和非标记的苯甲酰氯试剂，进行衍生反应，再加入基准内标溶液，涡旋震荡，上清液用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：占同文，
申请(专利权)人：上海谱领生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31