一种检测特鲁曲班光学异构体含量的方法技术

本发明专利技术提供一种检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，具体步骤包括：1)样品的准备；2)确定手性色谱分离条件；3)确定质谱条件；4)光学异构体含量测定。本发明专利技术基于手性高效液相色谱‑质谱/质谱联用技术，具有操作简单，定量准确、批量成本低，特别适用于临床药物检测/监测的需要，为体内/外特鲁曲班光学异构体的检测提供了一条新的思路和方法。

A method for detecting the content of optical isomers in a group of isomers

The invention provides a method for detecting specific Shandong argatroban optical isomer content. The specific steps include: 1) sample preparation; 2) to determine the separation conditions of chiral chromatography mass spectrometry; 3) to determine the conditions; 4) determination of optical isomer content. The invention chiral HPLC mass spectrometry / mass spectrometry based, has the advantages of simple operation, low cost, accurate quantity, especially suitable for clinical drug testing / monitoring needs, for in vivo detection of Shandong argatroban / special optical isomers and provides a new idea and method.

【技术实现步骤摘要】
一种检测特鲁曲班光学异构体含量的方法
本专利技术涉及一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术检测和监测生物样品中(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班光学异构体含量的方法，属于药物分析领域。
技术介绍
早在20世纪初发现，不同的手性药物对映体，具有不同的性质。通过对手性药物的深入研究，它的研究方法及技术得到了快速发展，人们对手性药物的药理活性也有了更深入的了解，并在短短几十年的时间里，将更多新的手性药物应用于临床。目前，常用的药物中，多数为手性分子，尤其是天然和半合成药物中的手性药物达99％以上，且其存在形式多为单一的对映体。但是，在上市的合成药物中手性药物只占40％，且以单一对映体形式存在的药物仅有六十余种，其余均为不同对映体混合物。手性药物对映体进入人体内后，与生物大分子相互识别、相互作用的过程具有立体选择性，因此导致其生物活性、药动学、药理学活性等方面的差异，有时甚至会引起严重的毒副作用。例如20世纪60年代震惊世界的“沙利度胺事件”导致大约8000个婴儿先天畸形。后来，经过大量的毒理学实验，人们发现，(R)-沙利度胺具有良好的抑制妊娠反应作用，但(S)-沙利度胺可强烈致畸。因此，建立手性药物光学异构体的体内检测方法对药物安全是非常重要的。特鲁曲班(Terutroban，CAS:165538-40-9)，有一个手性中心，两个光学异构体，即(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班，是一种口服血小板和血管壁中血栓素-前列腺素受体选择性阻断药，属于非前列腺素类可逆的血栓烷受体拮抗剂，是一种非选择性的具有高度亲和力且无内源性拟交感作用的β-受体阻滞剂。最近的研究表明，特鲁曲班的微出血的概率明显高于阿司匹林，尚未有重大或危及生命出血或颅内出血等报道。但有报道称，该副反应可能与其另外一个对映异构体(S)-特鲁曲班有关。因此，全面和深入的了解特鲁曲班不同对映异构体在生物体内的活性是非常重要的。同时，根据新药申报及临床药物管理的规定，不同的光学异构体应按照不同的化学实体对待。因此，同时建立(R)和(S)-特鲁曲班体内/外药物浓度的分析方法是非常必要的，也是手性药物进一步体内研究的基础。反相手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术结合了手性色谱柱对光学异构体的分离能力和质谱/质谱联用技术的高灵敏度，可以较好的解决手性药物的光学异构体的体内/外检测问题。然而，针对不同的分离对象，需要对进样量、柱温、洗脱剂(即流动相)、流速、母离子/子离子选择、碰撞能量、锥孔电压等大量条件和参数进行优化和筛选，既要保证光学异构体的分离，还要达到微量或痕量药物的检测要求，难度极大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术定量检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，特别适合临床药物检测/监测的应用。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：1)样品的准备：将生物样品或生物样品的匀浆液与乙腈混合以沉淀蛋白，通过离心分离沉淀，将离心所得上清液吹干，得到待分析样品；或将非生物样品用乙腈溶解、定容后得到待分析样品；2)确定手性色谱分离条件：根据(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的分离度≥1.5的要求，手性高效液相色谱分离中采用的流动相为甲醇或乙腈与水、易挥发性缓冲盐以及易挥发性酸的混合溶液，混合溶液中所述缓冲盐的浓度为0.1-10mM，所述酸的体积分数为0.01-0.5％，甲醇或乙腈与水的体积比为1.5-4:1；柱温为5-50℃；进样量为1-10μL；流动相流速为0.1-1mL/min，等度洗脱；3)确定质谱/质谱工作条件：采用三重四级杆质谱以及多反应监测扫描模式(MRM)；母离子和子离子分别为408.1和223.1；锥孔电压为30-50V；碰撞能量为35-50eV；4)光学异构体含量测定：对待分析样品进行手性高效液相色谱-质谱/质谱分析，然后利用外标法计算样品中的(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的含量。所述生物样品选自血浆、组织液、淋巴液、脑脊液、尿液、汗液等，或生物组织，如肝脏、肾脏、心脏、胰脏、大脑等。所述步骤1)中，沉淀蛋白所用乙腈的体积为生物样品体积的至少4倍。所述非生物样品包括特鲁曲班的制剂，如片剂、散剂、胶囊剂等，或者是需要检测的土壤、水、粪便等环境监测物。所述手性高效液相色谱采用反相涂敷型或键合型手性色谱柱，手性填料包括多糖衍生物类填料。所述缓冲盐包括甲酸铵、乙酸铵、碳酸铵或碳酸氢铵，所述酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。所述质谱/质谱的工作条件还包括：驻留时间为0.12-0.16s；ESI离子源温度为100-130℃；干燥气的温度为300-450℃，干燥气的流速为400-700L/h；毛细管电压为2.0-3.5KV。所述外标法(即配制(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的标准溶液，制作标准曲线，利用标准曲线计算待分析样品中的(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的含量)采用的标准曲线的范围为0.1-100ng/mL。本专利技术的有益效果体现在：1)光学异构体的分析灵敏度高、检出限低。对于手性药物的光学异构体的分析，现有方法是利用手性HPLC实现的，但是限于方法本身的限制，灵敏度较差，其最低检出限一般在μg/mL，无法实现微量和痕量样品的分析，在生物体内的应用较差；本专利技术中采用三重四级杆中的MRM扫描模式，在保证光学异构体分离的同时，极大的提高了灵敏度(ng/mL)，可以满足特鲁曲班临床检测的需要(最低检出限为0.1ng/mL)。2)可同时实现(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的检测。对于生物样品中药物浓度的检测，现有方法可以得到特鲁曲班异构体的总浓度，但是无法实现单一异构体的检测；本专利技术通过大量实验对手性高效液相色谱-质谱/质谱的条件进行优化，确定了母离子和子离子以及流动相的相关关键参数，首次实现了体内/外特鲁曲班对映异构体的定量分析，为特鲁曲班光学异构体的体内/外检测提供了技术支持，为研究手性药物的体内转化提供了新的思路。3)可实现自动化的检测，符合临床大样本监测的需要：本专利技术利用HPLC的自动进样功能、可实现无人值守；极大的节省了人力物力，满足多样品、大数据处理的需要。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1血浆中外消旋特鲁曲班的浓度检测基于手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术定量检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，以外消旋特鲁曲班为例，但本专利技术的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：1)样品的准备；2)确定手性色谱分离条件；3)确定质谱条件；4)光学异构体含量测定。一、样品准备①采集生物样品：取给予外消旋特鲁曲班的SD大鼠(5mg/kg，灌胃给药)血浆100μL(采血时间点1h)；②向上述生物样品中加入400μL乙腈，旋混30s后，12500转/分离心10min，取上清液室温下氮气吹干，得待分析样品，-80℃冻存；二、确定手性色谱分离条件上述待分析样品加入50μL的流动相中复溶，采用WatersXevoTQD分析(R)和(S)-特鲁曲班，条件如下：色谱柱：大赛璐IC色谱柱(150mm*2.1mm*3μm)。色谱条件：①自动进样，体积5μL；②流动相是乙腈:水＝80:20(体积比)的混合液(含体积分数0.01％的甲酸和10mM的甲酸铵)，流速为0.3mL/min，等度洗脱；③柱温箱温度为4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的准备：将生物样品或生物样品的匀浆液与乙腈混合以沉淀蛋白，通过离心分离沉淀，将离心所得上清液吹干，得到待分析样品；或将非生物样品用乙腈溶解、定容后得到待分析样品；2)确定手性色谱分离条件：根据(R)‑特鲁曲班和(S)‑特鲁曲班的分离度≥1.5的要求，手性高效液相色谱分离中采用的流动相为甲醇或乙腈与水、易挥发性缓冲盐以及易挥发性酸的混合溶液，混合溶液中所述缓冲盐的浓度为0.1‑10mM，所述酸的体积分数为0.01‑0.5％，甲醇或乙腈与水的体积比为1.5‑4:1；柱温为5‑50℃；进样量为1‑10μL；流动相流速为0.1‑1mL/min，等度洗脱；3)确定质谱/质谱工作条件：采用三重四级杆质谱以及多反应监测扫描模式；母离子和子离子分别为408.1和223.1；锥孔电压为30‑50V；碰撞能量为35‑50eV；4)光学异构体含量测定：对待分析样品进行手性高效液相色谱‑质谱/质谱分析，然后利用外标法计算样品中的(R)‑特鲁曲班和(S)‑特鲁曲班的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的准备：将生物样品或生物样品的匀浆液与乙腈混合以沉淀蛋白，通过离心分离沉淀，将离心所得上清液吹干，得到待分析样品；或将非生物样品用乙腈溶解、定容后得到待分析样品；2)确定手性色谱分离条件：根据(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的分离度≥1.5的要求，手性高效液相色谱分离中采用的流动相为甲醇或乙腈与水、易挥发性缓冲盐以及易挥发性酸的混合溶液，混合溶液中所述缓冲盐的浓度为0.1-10mM，所述酸的体积分数为0.01-0.5％，甲醇或乙腈与水的体积比为1.5-4:1；柱温为5-50℃；进样量为1-10μL；流动相流速为0.1-1mL/min，等度洗脱；3)确定质谱/质谱工作条件：采用三重四级杆质谱以及多反应监测扫描模式；母离子和子离子分别为408.1和223.1；锥孔电压为30-50V；碰撞能量为35-50eV；4)光学异构体含量测定：对待分析样品进行手性高效液相色谱-质谱/质谱分析，然后利用外标法计算样品中的(R)-特鲁曲班和(S)-特鲁曲班的含量。2.根据权利要求1所述一种检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈福欣，严贝贝，刘静，加晓丹，陈苏英，龚频，
申请(专利权)人：西安科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61