一种蝎毒素多肽及其合成方法技术

本发明专利技术公开了一种蝎毒素多肽，所述蝎毒素多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且其中第8位与第28位之间的S‑S键被替换为C‑S键。本发明专利技术蝎毒素多肽具有非常稳定的结构，通过在肽片段的合成中引入C‑S键替换容易断裂S‑S键，不仅可以起到稳固蛋白空间构象的作用，也可以促进复性过程的剩余二硫键的配对提高整体复性效率。另外本发明专利技术方法操作简便，收率高，获得的蝎毒素多肽具有更好的稳定性，以及较高的活性，几乎和天然蝎毒素相同。

Scorpion toxin polypeptide and synthetic method thereof

The invention discloses a scorpion toxin polypeptide, the scorpion toxin polypeptide amino acid sequence of SEQ ID No.1 shows, including S and between the eighth and twenty-eighth bit S key is replaced by the C S key. The present invention scorpion toxin polypeptide have a very stable structure, through the introduction of C in the synthesis of peptide fragments in S key S key S replacement is easy to break, not only can play the role of stable protein conformation, can also promote the remaining two disulfide bond pairing refolding process to improve the overall efficiency of refolding. In addition, the method has the advantages of simple operation and high yield, and the scorpion toxin polypeptide obtained has better stability and higher activity, and is almost the same as the natural scorpion toxin.

【技术实现步骤摘要】
一种蝎毒素多肽及其合成方法
本专利技术涉及蛋白质多肽药物领域，具体地说涉及一种蝎毒素多肽及其合成方法。
技术介绍
天然蝎毒素是一种发现于蝎子毒液，并经分离纯化得到的毒素蛋白，该蛋白具有治疗自身免疫性疾病的潜在药物可能，因此该毒素蛋白同时具有药物开发的潜能。目前获得蝎毒素可采用的方法主要有：一种是直接从蝎子来源的粗毒中提取，经过反相高效液相色谱C18柱分离纯化，从中分离出毒液中多种单一的组分。这种方法可以获得天然蝎毒素多肽，但是缺点在于得到的蝎毒素量非常微小，1毫克粗毒经过分离纯化，仅仅可以获得微克级目的毒素多肽，同时对于大规模生产操作不便。还有一种是采用化学合成来制备，这种方法在自动化肽合成仪上进行固相肽合成获取粗制直链产物，需要再经过二硫键重构和HPLC纯化过程，才能得到有活性的蝎毒素多肽。但是对于含有多对二硫键的蛋白在复性的过程中往往容易发生错配，致使复性效率较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种稳定性好，活性高的蝎毒素多肽。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种蝎毒素多肽，所述蝎毒素多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，且其中第8位与第28位之间的S-S键被替换为C-S键。本专利技术还提供上述蝎毒素多肽的合成方法，包括以下步骤：采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照SEQIDNo.1所示的序列将氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，且其中第28位Cys由式1所示的二氨基二酸构件单元所替换，第28位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至第9位，待第9位耦合完后，先脱除Alloc保护基团和Fmoc保护基团，再令第28位二氨基二酸构件单元与第9位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合第7位以及余下的氨基酸；最后经切割液处理以及复性后，获得所述蝎毒素多肽；进一步地，所述树脂为RinkAMamideresin或者2-Cl-Trt-Cl-resin。这两种树脂来源广，成本低，而且在实施本专利技术的过程中，专利技术人发现采用这两种树脂，产率更高。进一步地，所述缩合剂选自DIC、DCC、HATU、HBTU、PyAOP、PyBOP中的任意一种或任意几种。这里的几种是指两种以上。进一步地，合成温度为25～90℃。在实施本专利技术的过程中，专利技术人发现在这个温度区间内，可以试用于所有氨基酸的反应条件。进一步地，Alloc保护基团的脱除试剂为四(三苯基膦)钯与苯硫酚的混合物。进一步地，Fmoc保护基团的脱除试剂为含有20vt％哌啶的DMF溶液。进一步地，所述切割液为三氟乙酸、苯酚、水、TIPS、茴香硫醚、乙二硫醇的混合液。本专利技术有益效果为：本专利技术蝎毒素多肽具有非常稳定的结构，通过在肽片段的合成中引入C-S键替换容易断裂S-S键，不仅可以起到稳固蛋白空间构象的作用，也可以促进复性过程的剩余二硫键的配对提高整体复性效率。另外本专利技术方法操作简便，收率高，获得的蝎毒素多肽具有更好的稳定性，以及较高的活性，几乎和天然蝎毒素相同。附图说明图1是本专利技术蝎毒素多肽复性前HPLC色谱图。图2是本专利技术蝎毒素多肽复性后HPLC色谱图。图3是本专利技术蝎毒素多肽复性前质谱图。图4是本专利技术蝎毒素多肽复性后质谱图。图5是本专利技术蝎毒素多肽对Kv1.X家族的电流选择性的结果图(图中bar表示0.5nA,40ms)。图6a和图6b是本专利技术蝎毒素多肽对Kv1.3钾离子通道抑制效果及IC50曲线图。具体实施方式下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。实施例1二氨基二酸构件单元的制备反应式为：具体步骤为：化合物2：取1.5g(12.6mmol)高丝氨酸和1.34g(12.6mmol)碳酸钠于150mL圆底烧瓶中，用30mL水和15mL1,4-二氧六环溶解。反应体系在0℃下搅拌,分批加入4.26g(12.6mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)。添加完毕后，使反应体系恢复至室温(若反应体系有固体未溶解，可适量多加入1,4-二氧六环使其溶解)，搅拌过夜。用旋转蒸发仪除去溶剂中的1,4-二氧六环，之后用乙酸乙酯萃取剩余水相。保留水相，用6M的盐酸溶液调节pH至2。用乙酸乙酯萃取调节pH后的水相，合并有机相并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤有机相，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到白色固体。将白色固体转移至250mL带抽气支管的反应瓶中，氮气保护下加入用75mL二氯甲烷和18mL无水四氢呋喃使固体溶解。反应体系中加入叔丁基三氯乙酰亚胺酯4.5mL(5.51g,25.2mmol)。反应体系在氮气保护下，室温搅拌过夜。旋转蒸发仪除去溶剂，得到的固体用乙酸乙酯溶解后，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。将干燥后的有机相过滤，粗硅胶(100-200目)拌样，旋转蒸发仪旋干溶剂。柱层析分离法(硅胶柱)分离目的产物，淋洗剂乙酸乙酯：石油醚＝1:3。得化合物2为无色油状物，2.6g，产率52％。化合物3：取2.86g(7.2mmol)化合物2和2.85g(8.6mmol)四溴化碳，用26mL二氯甲烷溶解于150mL的圆底烧瓶中。将反应瓶置于冰浴中。取2.26g(8.6mmol)三苯基膦溶解于13mL二氯甲烷中，0℃下用恒压滴液漏斗逐滴加入反应体系中。滴加完毕后，使反应体系恢复至室温，反应2小时。反应完毕后，加入100mL二氯甲烷稀释。分别用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。将有机相过滤，用旋转蒸发仪除溶剂。用15mL二氯甲烷溶解得到的残余物，转移至500mL烧杯中，剧烈搅拌下用乙酸乙酯：石油醚＝1:1溶剂400mL溶解，搅拌十分钟。此过程中，会有大量白色固体三苯氧磷析出。将固体滤出，得到的有机相用旋转蒸发仪除去溶剂。用适量乙酸乙酯溶解得到的残余物，粗硅胶(100-200目)拌样，旋转蒸发仪旋干溶剂，柱层析分离法(硅胶柱)分离目的产物，淋洗剂乙酸乙酯：石油醚＝1:6。得化合物3为微黄色油状物，2.81g，产率85％。化合物4：称取2.0g(5.51mmol)Trt-半胱氨酸和0.58g(5.51mmol)碳酸钠置于100mL茄型瓶中，用10mL水和5mL乙腈溶解并将反应瓶放置于冰浴中。取0.58mL(5.51mmol)氯甲酸丙烯酯，0℃下逐滴加入至反应体系。滴加完毕后，使反应恢复室温，搅拌过夜。反应体系中的乙腈用旋转蒸发仪除去，剩余溶液加入20mL水，用6M盐酸溶液调节pH至2(调节过程中会有固体产生，可边加盐酸边加入乙酸乙酯搅拌，使最终水相的pH为2即可)。用乙酸乙酯萃取水相中的有机物，合并有机相后用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯。得到的剩余物用15mLDMF溶解，加入碳酸氢钠0.46g(5.51mmol)。取烯丙基溴0.58mL(6.61mmol)加入至反应体系中。反应体系在室温下搅拌约20小时。反应完毕后，用旋转蒸发仪除去溶剂，剩余物用乙酸乙酯溶解后，分别用水、饱和碳酸氢钠溶液、水、0.1M硫酸氢钾溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，用粗硅胶(100-200目)拌样，旋转蒸发仪旋干溶剂，柱层析分离法(硅胶柱)分离目的产物，淋洗剂乙酸乙酯：石油醚＝1:5。得化合物4为无色油状物，2.0g，产率74％。化合物5和化合物6：取1.68g(3.45mmol)化合物4用35mL二氯甲烷溶于25本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝎毒素多肽，其特征在于：所述蝎毒素多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且其中第8位与第28位之间的S‑S键被替换为C‑S键。

【技术特征摘要】
1.一种蝎毒素多肽，其特征在于：所述蝎毒素多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，且其中第8位与第28位之间的S-S键被替换为C-S键。2.如权利要求1所述的蝎毒素多肽的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照SEQIDNo.1所示的序列将氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，且其中第28位Cys由式1所示的二氨基二酸构件单元所替换，第28位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至第9位，待第9位耦合完后，先脱除Alloc保护基团和Fmoc保护基团，再令第28位二氨基二酸构件单元与第9位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合第7位以及余下的氨基酸；最后经切割液处理以及复性后，获得所述蝎毒素多肽；3.如权利要求2所述的蝎毒素多肽的合成方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：田长麟，张隆华，郭晓奇，陈晨晨，肖亮，周莉，
申请(专利权)人：中国科学技术大学先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34