无成瘤性MDCK细胞克隆株制造技术

本发明专利技术提供无成瘤性MDCK细胞克隆株，所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK‑C65，保藏编号为：C2016151。本发明专利技术通过单细胞克隆培养和筛选，得到了一株无成瘤性的MDCK细胞株（培养物名称：犬肾细胞MDCK‑C65，保藏编号C2016151），为我国开展流感疫苗的相关研究和生产提供无成瘤性的细胞株。

Non tumorigenic MDCK cell clone

The present invention provides no tumorigenicity of MDCK cell clones, the tumorigenicity of MDCK cell clones were preserved in Chinese culture collection, classification and nomenclature: typical canine kidney cell MDCK C65 and the preservation number of C2016151. The present invention and screened by single cell clone culture, obtained a strain free into MDCK cells of the tumor (culture name: canine kidney cell MDCK C65, accession number C2016151), non cancerous cell lines for our country to carry out related research and production of flu vaccine supply.

【技术实现步骤摘要】
无成瘤性MDCK细胞克隆株
本专利技术涉及一株无成瘤性MDCK细胞克隆株。
技术介绍
MDCK细胞（Madin-DabyCanineKidneyCells,MDCK）由Madin和Darby于1958年从美国CockerSpaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的适于流感病毒复制的3种细胞系之一。流感(Influenza)，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发。禽流感（BirdFlu或AvianInfluenza）是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，通常人感染禽流感死亡率约为33%。目前为止无论是流感还是禽流感未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疾病发生和流行最有效的手段。我国流感疫苗和禽流感疫苗生产主要采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。若采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，且生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。另外，贴壁型的传代细胞可用生物反应器微载体规模化培养，生产中可将细胞生长和病毒繁殖自动控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，与鸡胚直接增殖病毒的工艺和转瓶培养传代细胞增殖病毒的工艺相比具有明显优势。目前国际上已有几家企业已批准利用MDCK细胞生产流感疫苗。荷兰苏威制药公司（SolvayPharmaceuticals）生产的流感病毒裂解疫苗Influvac®TC于2001年在荷兰获得批准。诺华公司（NovartisVaccines）经过驯化获得的MDCK细胞株生产的Optaflu®于2007年获得了欧洲药品审评署（EMEA）的批准，Optaflu®在欧盟27个成员国、冰岛和挪威得到了广泛的使用。Optaflu®的上市标志着近50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。Flucelvax®灭活疫苗（甲型流感病毒亚型和乙型流感病毒）于2012年11月获得美国FDA批准用于18岁以上成人流感预防接种。阿斯利康(AstraZeneca)旗下的MedImmune公司生产的4价减毒活疫苗Flumist®于2010年获得美国FDA的批准用于2-45岁人群接种。MDCK细胞用于流感疫苗生产的主要争议是因为其具有成瘤性。2005年11月16日疫苗和相关生物制品顾问委员会（VRBPAC）组织召开的会议讨论了MDCK细胞作为细胞基质用于流感疫苗生产的相关事宜，并且着重讨论了MDCK细胞的成瘤性问题。会议期间诺华公司、荷兰苏威制药公司、美国医学免疫学公司分别做了MDCK细胞的研究报告。诺华公司的研究报告显示无血清悬浮培养型MDCK细胞的成瘤性非常强，10个细胞就可以对裸鼠成瘤，但是对该公司通过驯化获得的MDCK细胞株33016-PF的研究显示该细胞株对裸鼠不成瘤。荷兰苏威制药公司的研究报告显示MDCK细胞（CCL-34）母细胞（P56）接种的细胞量高于107细胞对裸鼠成瘤，建立的细胞库细胞传代至P98代时接种105细胞量就对裸鼠形成肿瘤。美国医学免疫学公司生产流感疫苗使用的细胞是该公司自主研发获得的无成瘤性MDCK贴壁细胞株，接种107细胞量对裸鼠不成瘤。目前，获得无成瘤性MDCK细胞株仍是各国科研人员研究的重点。
技术实现思路
本专利技术提供了一株无成瘤性MDCK细胞克隆株。本专利技术对ATCC引进的MDCK细胞（CCL-34）母细胞（P56）通过单细胞克隆、染色体分析和裸鼠接种筛选得到了无成瘤性的MDCK细胞克隆株，并在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行了保藏，保藏编号为：C2016151，分类命名：犬肾细胞MDCK-C65，保藏日期为：2016年7月27日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本专利技术的第一个目的是提供无成瘤性MDCK细胞克隆株，所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK-C65，保藏编号为：C2016151。本专利技术的第二个目的是提供无成瘤性MDCK细胞克隆株在流感疫苗生产中的应用。作为优选，所述MDCK细胞克隆株作为细胞基质用于流感疫苗生产。作为优选，将MDCK细胞克隆株接种动物后，所述MDCK细胞克隆株对接种动物不成瘤。本申请人通过单细胞克隆培养和筛选，得到了一株无成瘤性的MDCK细胞株（分类命名：犬肾细胞MDCK-C65，保藏编号C2016151），为我国开展流感疫苗的相关研究和生产提供无成瘤性的细胞株。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为MDCK单细胞克隆生长过程；其中，A.第9天，B.第13天；图2为MDCK细胞；其中，A.未克隆的MDCK细胞，B.MDCK-C65，C.MDCK-C72，Aa.培养前24h有岛样和似成纤维状，Ab.培养48h呈较致密的上皮型，Ba.培养24h似成纤维状，Bb.培养48h呈致密的上皮型，Ca.培养48h呈岛样生长，Cb.培养96h呈致密的上皮型.10X；图3为MDCK细胞染色体数量分布比例图；图4为活细胞接种裸鼠观察结果；其中，A.阳性对照Hela细胞，B.阴性对照MRC-5细胞，C.MDCK-C65。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11.材料1.1MDCK细胞株（CCL-34），2011年2月21日从ATCC引进，引进时细胞代次为P56，在ATCC的保藏号：58860056。在本实验室传代培养10代（P66）时建库保存，入库编号为GsAcc2B000009057。裸鼠成瘤结果为6/10（即试验的10只裸鼠中有6只长出肿瘤）。1.2DMEM(H)培养基，货号：BGLM-101.01，批号20150128、20160615，兰州百灵生物技术有限公司生产。使用时加10%胎牛血清（体积百分数）。1.3胎牛血清，批号：20150715，兰州百灵生物技术有限公司生产。1.40.25%胰蛋白酶（含EDTA），批号：20150715、20151228，兰州百灵生物技术有限公司生产。1.5D-PBSA（无钙镁离子），批号：20150312，兰州百灵生物技术有限公司生产。1.6U型96孔细胞培养板：批号140029，货号163320；24孔细胞培养板：批号7193630，货号142475；均为Thermo公司生产。1.7细胞培养瓶T25货号：430639，批号：12814601；T75货号：430641，批号：08514601；T225货号：431081，批号：28913010；均为corning公司生产。1.8冻存管1.5ml（货号：5000-1020，批号1115432，ThermoFisher本文档来自技高网...

【技术保护点】
无成瘤性MDCK细胞克隆株，其特征在于：所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK‑C65，保藏编号为：C2016151。

【技术特征摘要】
1.无成瘤性MDCK细胞克隆株，其特征在于：所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK-C65，保藏编号为：C2016151。2.权利要求1所述的无成瘤性MDCK细胞克隆株在流感疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：马忠仁，王家敏，马桂兰，乔自林，冯玉萍，马晓霞，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62