丹皮酚的全新结构活性代谢物制造技术

本发明专利技术首次发现了三种丹皮酚(PA)的活性代谢物。本实验公开了使用体外人肝微粒体温孵的方法简单、快速、大量地制备该三个代谢物，同时运用SPE小柱浓缩、提纯，并使用HPLC对这三个活性代谢物进行分离纯化。公开了使用小鼠离体子宫模型验证PA的三个活性代谢物的缓解子宫收缩的药理作用，从而为今后临床上痛经的治疗提供新的方法与思路。本发明专利技术提供的PA的三个活性代谢物结构如下所示。

【技术实现步骤摘要】
丹皮酚的全新结构活性代谢物
本专利技术属于医药
，具体涉及丹皮酚的活性代谢物的获得方法及其主要的应用。
技术介绍
丹皮酚(Paeonol，PA)又称牡丹酚，是一种从中药牡丹、芍药的根皮与徐长卿干燥根中提取出来的一种小分子酚类化合物。PA的化学名称为2-羟基-4-甲氧基-苯乙酮，分子量为166.17，呈现白色针状结晶。PA具有广泛的药理活性，主要包括抗心律失常、抗高血压、抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、增强细胞免疫、抗菌消炎等，临床上应用广泛。PA具有以下的化学结构：桂枝茯苓胶囊为理血剂，具有活血、化瘀、消癥之功效，临床上主要用于治疗子宫内膜炎、附件炎、月经不调、痛经、流产后阴道出血、子宫肌瘤、宫外孕、卵巢肿瘤、前列腺增生。桂枝茯苓胶囊由中药成分桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍、桃仁组成，其中牡丹皮与白芍中均含有PA。前期研究表明，PA不存在舒张子宫平滑肌等缓解痛经的作用，但是动物实验与离体子宫实验表明，灌胃给予PA以后能够达到缓解痛经的目的，因此寻找具有缓解痛经的相关PA的代谢物，用于痛经的治疗具有重要的价值。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种低毒、高效的PA的活性代谢物，从而为以后临床治疗痛经等相关疾病提供新的治疗方法。本专利技术提供的三个代谢物如下所示：PA代谢物生成方法的建立：建立合适的温孵方法使用人肝微粒体体外温孵的方法对PA进行温孵，以期生成PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3。PA代谢物结构确证方法的建立：依据相关软件如PeakView与MetabolitePilot等，对PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的质谱碎片信息进行分析，并与PA原药的质谱碎片信息比对，确证PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的正确性。PA代谢物分离纯化方法的建立：建立合适的提取分离纯化方法，获得高纯度的PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3。PA代谢物活性研究方法的建立：选取恰当的研究方法，研究PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3在治疗痛经方面的活性作用。本专利技术的有益效果：本专利技术所建立的PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的制备方法简单快速，能够迅速获得PA的这三个代谢物。同时通过对PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的活性研究，确证了其治疗痛经的活性，为今后临床上治疗痛经提供了新的治疗方法与思路。附图说明图1：样品经过SPE小柱浓缩与纯化后PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的色谱图图2：分离提纯后PA代谢物M1的色谱图图3：分离提纯后PA代谢物M2的色谱图图4：分离提纯后PA代谢物M3的色谱图图5：PA代谢物M1的二级碎片信息图6：PA代谢物M2的二级碎片信息图7：PA代谢物M3的二级碎片信息图8：原药PA的二级碎片信息图9：小鼠离体子宫模型中加入缩宫素前、加入缩宫素后以及加入PA代谢物M1溶液的小鼠离体子宫节律图图10：小鼠离体子宫模型中加入缩宫素前、加入缩宫素后以及加入PA代谢物M2溶液的小鼠离体子宫节律图图11：小鼠离体子宫模型中加入缩宫素前、加入缩宫素后以及加入PA代谢物M3溶液的小鼠离体子宫节律图图12大鼠痛经模型大鼠子宫中SOD活性、MDA含量与NO含量的测定结果具体实施方式本专利技术通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本专利技术仅限于此。1PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的制备方法PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3采用体外人肝微粒体I相+II相共温孵的方法进行。温孵中使用的人肝微粒体(HLMs，20mg/ml)购自中国上海瑞德肝脏疾病研究公司。本实验中所有温孵实验均在水浴锅中37℃水浴进行。所有的底物储备液均使用合适的有机溶剂进行溶解，且在温孵体系中有机溶剂的量不超过1％(v/v)，以保证人肝微粒体中CYPs的活性。HLMs在冰上融化，加入PBS缓冲液后与丙甲菌素(终浓度为40μg/ml)和MgCl2(终浓度为10mM)混合，4℃放置30min。随后加入底物PA(体系终浓度为500μM)，经过预温孵后，加入G-6-P、NADP+、PDH、UDPGA与单内酯启动反应，并使体系终体积为5ml。平行制备20份样品。经过37℃水浴6h后，在体系中加入5ml冰乙腈并振荡5min以终止反应，18000rpm×5min离心后，将全部20份样品的上清合并共200ml。2PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的浓缩提纯方法使用SupelcleanLC-18SPE(3ml)固相萃取小柱对收集的上清样品进行浓缩与提纯。具体操作方法如下：取固相萃取小柱，加入2ml甲醇活化；加入4ml超纯水平衡；将收集的上清样品与相同体积的1％甲酸混合均匀后，上样4ml；加入4ml超纯水淋洗；加入0.5ml甲醇洗脱并收集全部洗脱液25ml，40℃条件下挥干，使用10ml甲醇复溶。3PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的分离方法取100μl含有PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的甲醇复溶液，加入500μl甲醇沉淀蛋白后，使用Kromasil100-5C18柱(150×4.6mm)进样。流动相为0.5‰甲酸(A)与乙腈(B)。洗脱过程采用梯度洗脱，梯度为：0～1.0min(2％B)；1.0～3.0min(8％B)；3.0～6.0min(15％B)；6.0～19.0min(80％B)；19.0～22.5min(80％B)；22.5～23.0min(2％B)：23.0～30.0(2％B)。确定PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的出峰时间分别为6.11min、7.37min与7.76min。色谱图如图1所示。使用与上述测定方法相同的色谱柱、流动相与洗脱程序，应用HPLC进样分离，收集5.9～6.3min的洗脱液(含有PA代谢物M1)、7.2～7.6min的洗脱液(含有PA代谢物M2)以及7.6～8.0min的洗脱液(含有PA代谢物M3)。将所有相同时间的洗脱液合并，减压蒸干有机溶剂，剩余部分冷冻干燥，即得到PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的纯品。色谱图如图2、图3、图4所示。4PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的鉴定方法将获得的PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的纯品使用甲醇溶解，并使用高分辨率的LC-Q-TOF/MS质谱仪(配备ESI源)的全扫描模式对样品数据进行采集。获取PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的信息后，通过PeakView的FormulaFinder功能以及MetabolitePilot的数据处理功能，对PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3进行结构推断，同时对PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的二级碎片信息进行分析，并与PA原药的二级碎片信息进行比较，以确定PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的结构。二级碎片信息图如图5、图6、图7、图8所示。5PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3的活性研究5.1PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3舒张平滑肌的作用使用离体小鼠子宫模型实验研究PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3对子宫收缩的缓解作用。小鼠腹腔注射3天苯甲酸雌二醇后，脱颈本文档来自技高网...

【技术保护点】
三个丹皮酚(PA)的全新结构活性代谢物，其结构如下：

【技术特征摘要】
1.三个丹皮酚(PA)的全新结构活性代谢物，其结构如下：。2.如权利要求1中所述的化合物的制备方法，步骤如下：(1)PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3制备的前期准备PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3采用体外人肝微粒体I相+II相共温孵的方法进行。温孵中使用的人肝微粒体(HLMs，20mg/ml)购自中国上海瑞德肝脏疾病研究公司。本实验中所有温孵实验均在水浴锅中37℃水浴进行。所有的底物储备液均使用合适的有机溶剂进行溶解，且在温孵体系中有机溶剂的量不超过1％(v/v)，以保证人肝微粒体中CYPs的活性。HLMs在冰上融化，加入PBS缓冲液后与丙甲菌素(终浓度为40μg/ml)和MgCl2(终浓度为10mM)混合，4℃放置30min。随后加入底物PA(体系终浓度为500μM)，经过预温孵后，加入G-6-P、NADP+、PDH、UDPGA与单内酯启动反应，并使体系终体积为5ml。平行制备20份样品。经过37℃水浴6h后，在体系中加入5ml冰乙腈并振荡5min以终止反应，18000rpm×5min离心后，将全部20份样品的上清合并共200ml。(2)PA代谢物M1、PA代谢物M2、PA代谢物M3制备的提纯分离使用SupelcleanLC-18SPE...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广基，孙建国，仲云熙，金孝亮，谷世寅，阿基业，彭英，王瑜，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32