一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法技术

本发明专利技术涉及组织培养技术领域，公开了一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法。本发明专利技术所述方法将成熟胡椒种子灭菌，然后培养成胡椒幼苗，从幼苗子叶处分离出外种皮；将外种皮依次进行愈伤诱导培养和分化培养，获得胡椒体细胞胚胎。本发明专利技术所述方法选择外种皮作为外植体，调整愈伤诱导培养基和分化培养基的配方，以MS为基础培养基添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4‑D等成分，实现了高达20％的胡椒体细胞胚胎分化率，对高通量胡椒种苗繁育研究及转基因育种体系建立具有重要意义。

Method for obtaining pepper cell embryo with outer testa as explant

The invention relates to the technical field of tissue culture, and discloses a method for obtaining a pepper cell embryo with an outer seed coat as an explant. The method of the invention will mature pepper seed sterilization, then cultured into pepper seedlings, separating the testa from Cotyledon; testa will in turn induce callus and differentiation of cultured somatic embryos obtained pepper. The method of the invention has the choice of exotesta as explants, the induction medium and differentiation medium formula adjustment callus, based on MS medium supplemented with activated carbon, polyvinylpyrrolidone and 2,4 D and other ingredients, achieve up to 20% of the pepper body cell embryo differentiation rate, has important significance for High Flux Study on pepper seedling breeding and transgenic breeding system.

【技术实现步骤摘要】
一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法
本专利技术涉及组织培养
，具体涉及一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法。
技术介绍
胡椒(PipernigrumL.)为胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)多年生木质藤本植物，其果实具有辛辣香气，素有“香料之王”的美誉，是世界重要的香辛料作物，也是人们喜爱的调味品。在医学领域，胡椒可被用作健胃剂、解热剂和支气管粘膜刺激剂等。在食品工业上，可被用作抗氧化剂、防腐剂和保鲜剂等。作为一种深受人们喜爱的调味品和具有众多用途的热带农产品，胡椒已遍及亚州、非州、拉丁美洲三大洲近20个国家和地区。其中我国主要分布在海南、云南、广东、福建等地，种植面积近3×104hm2、年产量超过3.6×105t，居世界第五位。我国胡椒市场长期存在供不应求的局面，每年需进口约1.0×104t满足内需。随着我国人民生活水平的不断提高和饮食结构的变化，胡椒消费量还将大幅增加。市场需求的不断扩大给胡椒产业提供了广阔的发展前景。胡椒为多年生藤本植物，生产上胡椒种苗繁育以插条苗为主，该方法具有种苗与母本性状一致、后代发病率低等优点，但它对苗圃规划、母株选择、苗期培育等环节有着严格的要求，成本较高，且无法满足产业快速推进高通量种苗培育的要求，高通量种苗培育技术的缺乏限制了产业的进一步发展。体细胞再生是基于细胞全能型理论、以母本组织为外植体，在体外环境下通过愈伤诱导、分化等一系列过程获得组培苗的技术体系。胡椒体细胞再生体系的建立可以为种苗的高通量、规模化、商业化生产以及种植业的快速推广提供技术支撑。尽管体细胞再生技术已广泛应用于种苗培育、转基因育种等领域，但不同作物的再生体系与外植体选择、培养基类型、培养环境等因素密切相关。现有研究《胡椒组织培养研究》以胡椒实生苗芽尖、胚轴、叶片为外植体开展了胡椒体细胞再生研究，并提供了种子灭菌、体细胞再生培养方法，但其文献公布的方法种子萌发污染率高达30％-60％，而体细胞分化率不到1％(刘进平等，热带农业科学,2002,22(3):18-22.)。目前胡椒生产上还未有一种适合于胡椒体细胞胚胎发生的培育方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，使得所述方法能够显著提高胡椒体细胞胚胎的分化率。本专利技术的另外一个目的在于提供一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，使得所述方法能够显著降低种子萌发污染率。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，包括：步骤1、将成熟胡椒种子灭菌，然后培养成胡椒幼苗，从幼苗子叶处分离出外种皮；步骤2、将外种皮进行愈伤诱导培养获得愈伤组织，愈伤诱导培养基以MS为基础培养基，包含活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2,4-D；步骤3、将愈伤组织进行体细胞胚胎分化培养，获得胡椒体细胞胚胎，分化培养基以MS为基础培养基，包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。针对现有胡椒组织培养方法中种子萌发污染率较高以及分化率较低的问题，本专利技术从外植体的选择和培养基配方调整两个方面入手，实现了较高体细胞分化率的目的，在此基础上进行适宜的消毒措施，降低了种子萌发的污染率。作为优选，步骤1为：将成熟胡椒种子灭菌，然后置于无菌培养基中，28±2℃、避光培养至胡椒幼苗长出，子叶完全展开后，将外种皮从子叶顶端剥离，无菌培养基配方为1/2MS+2g/L活性炭。其中，所述灭菌具体为：将完整的成熟胡椒种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在超净台无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，接着将去除果肉的种子置于0.1％的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后转移至新的无菌容器中，无菌水清洗5次。作为优选，所述愈伤诱导培养基中活性炭浓度为2g/L、聚乙烯吡咯烷酮浓度为1g/L，2,4-D浓度为0.5mg/L；所述分化培养基中活性炭浓度为2g/L、聚乙烯吡咯烷酮浓度为1g/L。在本专利技术具体实施中，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮40(PVP-40)。作为优选，所述愈伤诱导培养和分化培养均在28±2℃下避光培养90天，每隔30天更换新培养基进行继代培养。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术方法中的成熟胡椒种子以成熟的热引1号(Pipernigrumc.v.Reyin-1)种子为材料，选择的种子完全成熟且无病虫害和机械损伤。本专利技术以不同外植体和培养基作为对照方法，与本专利技术方法在相同环境条件下进行培养，结果显示，本专利技术方法的种子萌发污染率仅为5％左右，而文献《胡椒组织培养研究》中的方法的污染率高达50％以上；在愈伤组织诱导率和体细胞分化率方面，本专利技术的效果也是显著高于各对照方法。由以上技术方案可知，本专利技术所述方法选择外种皮作为外植体，调整愈伤诱导培养基和分化培养基的配方，以MS为基础培养基添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4-D等成分，实现了高达20％的胡椒体细胞胚胎分化率，对高通量胡椒种苗繁育研究及转基因育种体系建立具有重要意义。具体实施方式本专利技术公开了一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下就本专利技术所提供的一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法做进一步说明。实施例1：本专利技术所述方法取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将种子从果穗剥离，无菌环境下75％(V/V)酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，再将种子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后将种子转移至新的无菌容器中，无菌水清洗5次，获得无菌种子。无菌环境下，将无菌种子置于无菌培养基中萌发，(28±2)℃、避光培养60天。培养基配方为1/2MS+2g/LAC(活性炭)。待胡椒幼苗完全长出后，将外种皮从子叶顶端剥离。将外种皮置于愈伤诱导培养基中，(28±2)℃、避光培养90天。培养基配方为MS+2g/LAC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，90天后可诱导出愈伤组织。将愈伤组织转移至分化培养基中，(28±2)℃、避光培养。培养基配方为MS+2g/LAC+1g/LPVP-40，每隔30天将材料转移至新的培养基中继带培养，连续培养90天后可得到胡椒体细胞胚胎。实施例2：对照方法1(以叶片、胚轴为外植体采用实施例1中培养方法)取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将果实从果穗剥离，无菌环境下75％(V/V)酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，再将种子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后将胡椒种子转移至新的无菌容器中，无菌水清洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，其特征在于，包括：步骤1、将成熟胡椒种子灭菌，然后培养成胡椒幼苗，从幼苗子叶处分离出外种皮；步骤2、将外种皮进行愈伤诱导培养获得愈伤组织，愈伤诱导培养基以MS为基础培养基，包含活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4‑D；步骤3、将愈伤组织进行体细胞胚胎分化培养，获得胡椒体细胞胚胎，分化培养基以MS为基础培养基，包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。

【技术特征摘要】
1.一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，其特征在于，包括：步骤1、将成熟胡椒种子灭菌，然后培养成胡椒幼苗，从幼苗子叶处分离出外种皮；步骤2、将外种皮进行愈伤诱导培养获得愈伤组织，愈伤诱导培养基以MS为基础培养基，包含活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4-D；步骤3、将愈伤组织进行体细胞胚胎分化培养，获得胡椒体细胞胚胎，分化培养基以MS为基础培养基，包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：将成熟胡椒种子灭菌，然后置于无菌培养基中，28±2℃、避光培养至胡椒幼苗长出，子叶完全展开后，将外种皮从子叶顶端剥离，无菌培养基配方为1/2MS+2g/L活性炭。3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述灭菌具体为：将完整的成熟胡椒种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在超净台无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，接着将去除果肉的种子置于0.1％的升...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽松，范睿，伍宝朵，郝朝运，谭乐和，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院香料饮料研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46