一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法技术

本发明专利技术涉及一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、分化及增殖培养、生根培养和瓶苗移栽。本发明专利技术的割手密抑菌组培过程中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了割手密组培技术环节，降低了割手密组培成本；而且操作简单，只需按不同的培养基配方配制后即可使用，实用性强，推广性好。本发明专利技术的割手密抑菌组培方法与常规的割手密组培方法相比，可以降低成本10％以上。

Tissue culture method for culturing cutting hand dense by using bacteriostatic culture medium

The present invention relates to antibacterial cultured plant tissue culture method of S.spontaneum, including culture container disinfection, preparation, sterile water preparation, incubation, differentiation and proliferation culture, rooting and transplanting medium bottle. The invention of S.spontaneum inhibition during tissue culture, culture medium and container without autoclaving, reducing the workload and energy consumption, simplifies the S.spontaneum tissue culture technology links, reduce the cost of tissue culture S.spontaneum; and the operation is simple, only according to the different culture medium can be used after preparation. Strong practicability, good generalization. Compared with the conventional hand cutting and tissue culture method, the cutting hand closed bacteriostatic tissue culture method can reduce the cost by more than 10%.

【技术实现步骤摘要】
一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法
本专利技术涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法，属生物

技术介绍
割手密(SaccharumspontaneumL.)，又名甜根子草、小巴茅，为禾本科甘蔗属多年生的草本植物，具有抗逆性强、适应性广、分蘖多等优良特性，主要分布在热带、亚热带两大气候区，在我国南自海南岛，北至秦岭，东起台湾东部，西至西藏的雅鲁藏布江均有分布。割手密在甘蔗属中种类丰富，且含有较高糖分，是甘蔗属中最早用于甘蔗杂交育种的种质资源，也是最有应用价值的野生种质资源，在甘蔗育种中具有重要的地位和作用。国内外甘蔗育种专家利用割手密的优质基因对栽培蔗遗传基因进行改良，先后培育出了多个优良的甘蔗栽培品种，在生产上得到推广应用。虽然利用割手密与栽培甘蔗进行有性杂交，进而育成新的甘蔗品种，是甘蔗育种中的一种有效的途径，然而在实际生产中却面临各种问题，尤其是花期不遇甚至不开花成了它们进行有性杂交的严重障碍。科研工作者通过多年研究发现，利用体细胞杂交可以克服这个障碍，然而在进行体细胞杂交过程中，外植体培养、获得愈伤组织、再分化成苗等是不可缺少的组培环节。割手密组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的割手密组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过抑菌的方法来改造培养基，使培养基在不需要进行高温高压灭菌，就能够使割手密正常生长。这样，一方面可以降低割手密组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展割手密组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对割手密生长产生毒害或抑制，即不影响割手密的正常生长，从根本上简化了割手密组织培养。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法。本专利技术的目的是通过以下方法实现的。本专利技术的一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、分化及增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化及增殖培养基为：MS+0.5～2mg/LIAA+0.5～2mg/LKT+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+2～5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固，备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：取田间生长健壮且无病虫害的割手密无性系顶端部分，用体积比为75％的乙醇表面消毒，剥离外层叶鞘，取白色心叶的肥厚带中生长点以上6cm内的幼嫩心叶，将其切成不超过3mm厚度的圆片，接种于诱导培养基上，培养30d后诱导出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.分化及增殖培养：将诱导出的割手密愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步诱导出幼芽；将幼芽接种到增殖培养基上，逐步发育成丛生苗，每15d转接一次，大量增殖；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1600Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1800Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的基质中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃，所述透水性好的基质，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。本专利技术的应用效果：本专利技术的抑菌组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，在割手密诱导培养、增殖培养、生根培养各个阶段，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。1.诱导培养：通过实验证实，本专利技术的一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法与常规的割手密组培方法相比，结果如表1所示，在诱导培养阶段，外植体诱导率无明显差异。表1本专利技术的抑菌组培方法对割手密诱导培养的影响组培方式外植体数外植体污染数诱导率(％)常规组培方法752665.3抑菌组培方法792765.82.增殖培养：本专利技术的抑菌组培方法与常规组培割手密的增殖倍数和污染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率二个指标都差异不显著。表2本专利技术的抑菌组培方法对割手密增殖倍数和污染率的影响组培方式增殖倍数平均污染率(％)常规组培方法2.20.5抑菌组培方法2.30.43.在组培苗生根过程中，本专利技术的抑菌组培方法与常规的割手密组培方法相比，由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，割手密组培苗生根效果更好，结果如表3所示，生根率和污染率的差异不显著。表3本专利技术的抑菌组培方法的割手密瓶苗生根情况组培方式生根率(％)平均污染率(％)常规组培方法810.6抑菌组培方法830.54.成本分析：本专利技术的抑菌组培方法与常规组培的成本分析见表4。本专利技术组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从直接费用计算，每年可以节约5.5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。常规组培还需要添置高压锅等设备及其维修，并且存在实验室安全等。表4本专利技术的割手密简便组培方法与常规组培的成本分析表本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术的割手密抑菌组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了割手密组培技术环节，降低了割手密组培成本。2.本专利技术的割手密抑菌组培方法，操作简单，只需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、分化及增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；(2)培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L 2,4‑D+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化及增殖培养基为：MS+0.5～2mg/L IAA+0.5～2mg/L KT+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+2～5mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2,4‑D，指2,4‑二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6‑糠氨基嘌呤；所述NAA，指α‑萘乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固，备用；(3)无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；(4)诱导培养：取田间生长健壮且无病虫害的割手密无性系顶端部分，用体积比为75％的乙醇表面消毒，剥离外层叶鞘，取白色心叶的肥厚带中生长点以上6cm内的幼嫩心叶，将其切成不超过3mm厚度的圆片，接种于诱导培养基上，培养30d后诱导出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；(5)分化及增殖培养：将诱导出的割手密愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步诱导出幼芽；将幼芽接种到增殖培养基上，逐步发育成丛生苗，每15d转接一次，大量增殖；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1600Lx；(6)生根培养：取高度为3～5cm苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1800Lx；(7)瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的基质中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃，所述透水性好的基质，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。...

【技术特征摘要】
1.一种利用抑菌培养基培育割手密的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、分化及增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；(2)培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化及增殖培养基为：MS+0.5～2mg/LIAA+0.5～2mg/LKT+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+2～5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固，备用；(3)无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；(4)诱导培...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨颖颖，高世武，林庆良，许莉萍，阙友雄，苏亚春，郭晋隆，吴期滨，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35