一种中药何首乌蛋白质的提取方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种中药何首乌蛋白质的提取方法，将何首乌的干燥块根粉末，脱脂处理后加入５０ｍｍｏｌ　ｐＨ为７．４的Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］－ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］缓冲液，冷冻离心得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵，边加边搅拌，冷冻离心收集硫酸铵饱和度为４０～７０％之间的沉淀；将所得沉淀转移至透析袋，用双蒸水透析，对透析截留液进行冷冻离心，上清液过ｓｅｐｈａｄｅｘＧ７５柱，用双蒸水洗脱，收集２８０ｎｍ有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即得中药何首乌蛋白质。按上述方法制备的中药何首乌蛋白质能促进脾淋巴细胞增殖，可应用于制备增强免疫力的药物中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质的提取方法，具体是一种中药何首乌蛋白质的提取方法及其应用。
技术介绍
中药何首乌为蓼科植物何首乌(尸ofygo"甽mw/n;/7oraw Thunberg)的干燥块根。研究表明， 中药何首乌具有抗肿瘤、保肝、降血脂、调节机体免疫功能等作用。许多中药的抗癌活性及保肝 作用等均与调节机体免疫功能有关。淋巴细胞能在保存自身的前提下识别、杀伤和排斥外来 异已分子及癌变细胞，与机体的免疫功能密切相关。中药何首乌中的蛋白质含量为2.36%， 是中药何首乌的重要组成成分。但是人们至今尚未提取出中药何首乌的蛋白质。
技术实现思路
为了确定中药何首乌蛋白质是否为中药何首乌调节机体免疫功能的有效部位之一，本发 明对其进行了提取分离，并测定了其体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响，以及对刀豆蛋 白A(conA)、脂多糖(LPS)诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。本专利技术提供的提取方法， 可为进一步将中药何首乌蛋白质研究开发成药物或保健品打下基础。本专利技术的目的在于提供一种中药何首乌蛋白质的提取方法。本专利技术的目的还在于提供中药何首乌蛋白质在制备增强免疫力药物中的应用。实现本专利技术目的的技术方案如下一种中药何首乌蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤(1) 将何首乌的干燥块根粉末，加入正己垸浸没，脱脂2 3次，每次4 6小时(2) 离心，回收溶剂，风干残渣；(3) 按lg何首乌的干燥块根粉末60 70mL的比例加入50mmolpH为7.4的Na2HP04-NaH2P04缓冲液，4 6'C搅拌10 15小时，在4 6°C、 12000 13000rpm条件下冷冻离心 10 15min，得上清液A:(4) 残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末40 50mL的比例加入上述缓冲液，4 6°。搅 拌9 11小时，在4 6。C、 12000 13000rpm条件下冷冻离心10 15min，得上清液B;(5) 残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末30 40ml的比例加入上述缓冲液，4 6'C搅拌7 9小时，在4 6。C、 12000 13000rpm条件下冷冻离心10 15min，得上清液C;(6) 合并上清液A、 B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵，边加边 搅拌，冷冻离心收集硫酸铵饱和度为40 70%之间的沉淀，冷冻离心的条件为4 6°C， l訓0 12000rpm， 15 20min;(7) 将所得沉淀转移至透析袋，4 6°C，用双蒸水透析36 48小时，每隔6 8小时换 一次双蒸水；(8) 在4 6°C、 11000 12000rpm对透析截留液进行冷冻离心15 20min，上清液过 sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即得中药何首乌 蛋白质。实验结果表明，本专利技术提取的中药何首乌蛋白质能促进脾淋巴细胞增殖，可应用于制备 增强免疫力的药物中。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果1、 首次从中药何首乌中提取出中药何首乌蛋白质；2、 实验结果表明，本专利技术提取的中药何首乌蛋白质能促进脾淋巴细胞增殖，可应用于制 备增强免疫力的药物中。具体实施例方式实施例1本实施例所用何首乌产自广东德庆。将何首乌(尸ofygomw7 7m^;/7w""wThunberg)的干燥块根粉末，加入正已垸浸没，脱脂2 次，每次4小时；离心，回收溶剂，残渣风干后，按lg何首乌的干燥块根粉末60mL的比 例加入50mmolpH为7.4的Na2HP04-NaH2P04缓冲液，4 6'C搅拌10小时。冷冻离心(条 件4°C， 10min， 12000rpm)，得上清液A;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末40mL的 比例加入上述缓冲液，4 6'C搅拌9小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液B;残渣再按 lg何首乌的干燥块根粉末30ml的比例加入上述缓冲液，4 6'C搅拌7小时，冷冻离心(条 件同前)，得上清液C。合并上清液A、 B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫 酸铵(边加边搅拌)至30%饱和度，冷冻离心(条件4'C， 15min， 11000rpm);向所得上清液中继续缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至40%的饱和度，冷冻离心(条件4'C， 15min， 11000rpm)，得沉淀I (硫酸铵饱和度30 40%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加 入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至50%饱和度，冷冻离心(条件4°C, 15min， 11000rpm)， 得沉淀II (硫酸铵饱和度40 50%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加 边搅拌)至60°/。饱和度，冷冻离心(条件4'C， 15min， 11000rpm)，得沉淀III (硫酸铵饱 和度50 60%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至70%饱 和度，冷冻离心(条件4'C， 15min， 11000rpm)，得沉淀W (硫酸铵饱和度60 70%的蛋 白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至80%饱和度，冷冻离心(条 件4°C， 15min， 11000rpm)，得沉淀V (硫酸铵饱和度70 80%的蛋白质)。分别将所得沉 淀I、沉淀II、沉淀III、沉淀IV、沉淀V转移至透析袋，用双蒸水透析36小时(4 6°C，每 隔6小时换一次双蒸水)。对透析截留液进行离心(条件4°C， 15min， 11000rpm)，上清液 过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即分别得中药何首乌蛋白质i、蛋白质n、蛋白质ni、蛋白质iv、蛋白质v。测定实施例i获取的蛋白质i 、蛋白质n、蛋白质m、蛋白质iv、蛋白质v体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响，以及对conA， LPS诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。 1、 试验试剂刀豆蛋白A (ConA)、脂多糖(LPS)、硫酸酚嗪甲脂(PMS)、 二甲氧唑黄(XTT)均购 于美国Sigma公司。胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产。RPMI-1640为美国Gibco 公司产品。 2、试验方法(1) 小鼠脾细胞悬液制备无菌取小鼠(Balb/c、雄性、SPF级)脾脏，制备脾细胞悬 液，其活力> 95%,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度至5 X 109L—1 。(2) 不同蛋白质对淋巴细胞增殖的直接作用取上述细胞悬液190rtV孔加入96孔板。 空白对照组加入无血清培养液10ft;各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的 各蛋白质10叱(终浓度均为2S0^.mL—1 )。(3) 不同蛋白质对ConA诱导T细胞增殖的影响取上述细胞悬液180W7孔加入96孔 板，同时设空白对照组及模型组。空白对照组加入无血清培养204L，其它各组加入ConA104L(终浓度5Pg mL")。模型组加入无血清培养液10叱，各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质10A (终浓度均为250Pg.mL—1 )。(4)不同蛋白质对LPS诱导B细胞增殖的影响除将ConA换成LPS(终浓度为104g tnL勺 外，其它均同(3)。将上述各96孔板置36°C， 5%〔02培养箱中培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药何首乌蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤：　（１）将何首乌的干燥块根粉末，加入正已烷浸没，脱脂２～３次，每次４～６小时；　（２）离心，回收溶剂，风干残渣；　（３）按１ｇ何首乌的干燥块根粉末：６０～７０ｍＬ的比 例加入５０ｍｍｏｌ　ｐＨ为７．４的Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］－ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］缓冲液，４～６℃搅拌１０～１５小时，在４～６℃、１２０００～１３０００ｒｐｍ条件下冷冻离心１０～１５ｍｉｎ，得上清液Ａ；　（４）残渣再按１ｇ何首乌 的干燥块根粉末：４０～５０ｍＬ的比例加入上述缓冲液，４～６℃搅拌９～１１小时，在４～６℃、１２０００～１３０００ｒｐｍ条件下冷冻离心１０～１５ｍｉｎ，得上清液Ｂ；　（５）残渣再按１ｇ何首乌的干燥块根粉末：３０～４０ｍｌ的比例加入上述缓 冲液，４～６℃搅拌７～９小时，在４～６℃、１２０００～１３０００ｒｐｍ条件下冷冻离心１０～１５ｍｉｎ，得上清液Ｃ；　（６）合并上清液Ａ、Ｂ和Ｃ，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵，边加边搅拌，冷冻离心收集硫酸铵饱和度为４０～７ ０％之间的沉淀，冷冻离心的条件为：４～６℃，１１０００～１２０００ｒｐｍ，１５～２０ｍｉｎ；　（７）将所得沉淀转移至透析袋，４～６℃，用双蒸水透析３６～４８小时，每隔６～８小时换一次双蒸水；　（８）在４～６℃、１１０００～１２０ ００ｒｐｍ对透析截留液进行冷冻离心１５～２０ｍｉｎ，上清液过ｓｅｐｈａｄｅｘＧ７５柱，用双蒸水洗脱，收集２８０ｎｍ有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即得中药何首乌蛋白质。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张敏，刘一流，李续娥，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]