【技术实现步骤摘要】
鉴于本专利技术得到美国卫生和保健部Rol HL29688号和RR 053-99号拨款资助，美国政府对本专利技术享有权利。本专利技术与蛋白纯化方法有关。更具体地说，本专利技术与糖、多元醇、氨基酸或盐的存在下，采用柱层析技术纯化抗血友病因子ⅧC(以下简称AHF)的高回收率和高分辨率的方法有关。用此法制备的AHF纯度高。凝血促进剂蛋白因子Ⅷ(AHF)是一种在血友病病人血浆中具有纠正凝固缺陷的一种血浆蛋白。事实上，AHF活性是以在血友病A血浆中其诱导凝固的能力来测量的。一个单位AHF是指1毫升的正常男性成人血浆中所存在的AHF量。本文所采用的标准，即世界卫生组织标准，可以从英国伦敦汉普斯特(Hampstead)，好莱.希尔(Holly Hill)的国立生物学标准和质量控制研究所得到。AHF在临床治疗方面的主要应用一直是给血友病病人做静脉注射。起初，这种应用包括全血和新鲜的冷冻血浆做静脉滴注，这种方法需要长时间的滴注，而且常常会引起血容量过多。血浆冷沉淀物(“Cryo”)的应用仍然需要很长的滴注时间。这种Cryo不能完全溶于滴注所用的溶剂中，因而需要过滤。它...
【技术保护点】
纯化蛋白质的方法，该方法是在选自糖、多羟基醇、氨基酸和盐的水合作用添加剂存在下，并且在添加剂的浓度是以使从柱上回收的上述蛋白质的回收率、纯度和分辨率中至少一项有显著增加的条件下，用柱层析使蛋白质纯化。
【技术特征摘要】
书以及附图，本发明的这样、那样的目的和特点，对本专业领域的技术人员来说是清楚的。图1是AHF产率对在各种糖存在下牛血清白蛋白(BSA)的优先水合作用作图。图2是血浆AHF的纯化程度对在各种糖存在下BSA的优先水合作用作图。图3是二乙氨乙基-2-羟丙基葡聚糖阳离子交换层析法和氨基己基-琼脂糖亲和层析法得到的AHF分辨率的关系图。本发明的目的是提供在能使本法提纯的蛋白产率、分辨率和纯度中至少一项显著增加的足够浓度的糖、多元醇、氨基酸或盐的存在下，用柱层析法纯化蛋白的方法。如上所述，业已发现糖、多元醇、氨基酸和盐(水合作用调节剂)能通过蛋白质的优先水合作用，稳定蛋白质结构。有人认为，蛋白质水溶液中，蛋白质的优先水合作用参数的最适增加(或它的优先互相作用参数的最适减少)能促进蛋白质凝聚，增加蛋白质分子的折叠。有人进一步认为，其结果是，蛋白质的疏水基比在水溶液中埋得更牢，其表面变得更亲水。本发明的发明者已经发现，蛋白质与水合作用添加剂的接触能引起蛋白质的离子相互作用的明显增加，和疏水相互作用的明显减少。这些水合作用添加剂的作用是可逆的，并取决于其在蛋白质溶液中的浓度。本发明利用糖、多元醇、氨基酸和盐的这些性质，以有利于增强蛋白质选择性地结合到离子柱上，以及有利于增强蛋白质选择性地从疏水性亲和柱上洗脱。首先，本发明参照一个优选的实施方案加以叙述，该方案包括先通过离子交换层析柱，然后通过疏水性亲和层析柱这样一种连续操作方法从冷沉淀物纯化AHF。但是，本发明不限于这些层析分离法的一起应用，也不只限于纯化AHF，如果愿意，可以只采用二种层析分离法中之一种，并可将本发明应用于不仅存在于血浆而且存在于其它生物体液或生理体液中的难纯化蛋白的纯化。按照一个优先的实施方案，根据P.R.Foster等人(Vox Sang 42∶180(1982))改良的，众所周知的J.Newman等人的方法(Brit.J.Hamatol 21∶1(1971))从血浆制备冷沉淀物。现特将这二篇文章透露的内容按参考文献综合如下简单地说，用锤式粉碎机将冷冻血浆粉碎至“雪花”大小，并移至温度保持在15-28℃搅拌速度保持在55转/分钟的解冻容器中，使其融化。融化了的液体和悬浮的冷沉淀物靠重力作用排出，并收集于冷冻离心机中，用离心法收集冷沉淀物。将这种冷沉淀物以1/10的起始体积溶于含0.02M三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.02M枸橼酸钠和0.02M氯化钠的缓冲液(缓冲液Ⅰ)中。随意地加入氢氧化铝，以吸附凝固因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和一些纤维素蛋白元，纤维结合素以及维勒布兰德(遗传性假血友病)蛋白。然后标本离心，除去氢氧化物，收集上清液。加山梨醇到样品中，直到其浓度达1M。滴加0.02M盐酸(HCl)到该溶液中，使其呈酸性，PH6.6。然后加入终浓度为4%的聚乙二醇(PEG)，用以沉淀纤维蛋白元，纤维结合素和维勒布兰德(遗传性假血友病)蛋白。离心的上清液作柱层析。二乙氨乙基-2-羟丙基-葡聚糖A-25凝胶(QAE-Sephadex-A-25)和二乙氨乙基-2-羟丙基-琼脂糖凝胶4 B Fast Flow(QAE-Sepharose 4 B Fast Flow)购自(Pharmacia Chemicals Inc.Piscataway，新泽西州)。在室温和慢速搅拌条件下，将QAE-Sephadex A-25浸泡于0.5M Na Cl过夜(或在接近沸腾的温度下浸泡1～2小时)。然后将相当于样品滤液中所含2/3总蛋白毫克数的膨胀了的树脂(以毫升计)装入层析柱(如果用QAE-Sepharose Fast Flow，约用相当于1/4蛋白量的凝胶就可能足够了)。层析柱中凝胶宽/长比率约为2∶1。然后分别用5体积的1M Na Cl/0.01M Tris(PH7.4)和5体积的0.5M-Na Cl/0.02M Tris(PH7.4)和5体积的含0.02M Tris(PH7.4)0.15M Na Cl和1M山梨醇的缓冲液(缓冲液Ⅱ)。以每分钟约1%柱床体积的流速把样品滤液装柱，然后用2体积的缓冲液Ⅱ，以每分钟3%柱床体积的流速洗涤柱子。接着依次用5体积的含0.02M Tris(PH7.4)、0.20M Na Cl和1M山梨醇的缓冲液(缓冲液Ⅲ)和2体积的含0.02M醋酸钠(Na Ac)PH6.0、0.035M氯化钙(Ca Cl2)和1M山梨醇的缓冲液(缓冲液Ⅳ)进行洗涤。AHF蛋白用2体积的含0.1MNa Ac(PH6.0)、0.25M Ca Cl、10%甘油和0.01%～0.05%吐温-80＊(多聚山梨酸酯-80，实验化学工业公司，威尔明顿，德拉韦)(吐温的应用对于用QA E-sepharose 4 B-Fast Flow获得最高的AHF产率特别重要)的缓冲液(缓冲液Ⅴ)洗涤。收集相当于柱床体积25%的各部分洗脱液，检查每一部分洗脱液的AHF活性。根据改良的Bradford法(参见M.M.Bradford一种快速、灵敏的利用蛋白-染料结合原理的微克量蛋白定量法，Anal.Biochem 72∶248-254(1976)]检测相应各部分洗脱液的蛋白浓度。该文报告的内容被收进参考资料。合并含AHF活性的各分部QAE洗脱液，并用4体积水稀释之。氨基己基(AH)-琼脂糖树脂(购自新泽西州Piscataway市Pharmacia Chemicals Inc.)以10体积0.5MNa Cl浸泡过夜。以1000单位的AHF用4ml浸泡凝胶的比例，将膨胀的凝胶装入宽/长比率为1∶1的层析柱，并用5体积的0.02MNa Ac(PH6.0)0.15M Na Cl和0.02M Ca Cl2(缓冲液Ⅵ)淋洗。将经过稀释的QAE洗脱液样品上柱，并分别用10体积的缓冲液Ⅵ，5体积的含0.02MNa Ac，PH6.0、0.35MNa Cl和0.02MCa Cl的缓冲液(缓冲液Ⅶ)和2体积的含0.02M Tris PH7.4，0.35M Na Cl和0.02M Ca Cl2的缓冲液(缓冲液Ⅷ)淋洗。AHF用2体积的含0.1 M Tris(PH7.4)，0.35M Ca Cl2，1M山梨醇和0.1%吐温-80(多聚山梨酸酯80)的缓冲液(缓冲液Ⅸ)洗脱。测定各分部洗脱液的AHF活性，并将有AHF活性的各分部合并。含AHF各分部洗脱液中的蛋白浓度用Weissman氏法测定。[Schaffner，W.和Weissman，C一种快速、灵敏和特异的用于测定洗脱液中蛋白质的方法。Anal.Biochem 56∶502-514(1973)。这篇文献报告的内容特地被收进参考资料。]简短地说，样品用终浓度为15%(v/v)的三氯醋酸沉淀，然后通过硝基纤维素滤膜(马萨诸塞州梅德弗德市Millipore公司生产的微孔过膜HAWP)过滤，收集沉淀物。沉淀物用氨基黑进行染色，并用甲醇-醋酸-水混合液进行脱色，切下色斑，洗脱入1ml氢氧化钠-EDTA(乙二胺四乙酸)，读取A630值。采用下法可使QAE柱再生先用最大浓度为2M的梯度Na Cl溶液进行洗涤，然后用0.1NNa OH洗，以除去蛋白，用乙酸或非离子型表面活性剂洗，以除去脂类，最后用缓冲液Ⅱ洗，以重新建立平衡。采用下法可使AH琼脂糖再生分别用1体积水，2体积正丁醇，1体积95%乙醇，5体积1MNa Cl，5体积0.5M Na Cl 0.02MNa Ac，PH6.0和5体积缓冲液Ⅵ。从这些连续的层析分离步骤得到的AHF的产率、纯度和浓度是高的。本发明的主要特点是水合作用添加剂的应用，以及在AHF其它蛋白纯化过程中这种水合作用添加剂浓度的控制，以促进AHF和其它蛋白吸附到离子交换树脂上，并促进其从疏水性亲和树脂上的解离，并获得高产率回收，分辨力高、纯度高的蛋白。本发明的发明者已经发现，水合作用添加剂的应用可以起这样的作用(a)明显增强AHF与阴离子交换树脂的亲和力，有选择性地使其停留在相当窄的柱段内;(b)明显地使AHF与疏水性树脂的亲和力失去稳定，从而使其容易洗脱。在阴离子交换层析法中选用这一系列特别的材料和步骤的理由如下(a)用缓冲液Ⅱ把样品装上阴离子柱并用相同的缓冲液洗涤这种方法，可以使AHF蛋白离子结合到树脂上，而让大多数其它蛋白洗脱掉。(一般说来，阴离子交换柱能获得的初次纯化程度比疏水性和柱高)。缓冲液Ⅱ含有一个浓度的水合作用添加剂，在该浓度下，AHF对阴离子交换柱的亲和力比许多其它蛋白对这种柱的亲和力强。(b)缓冲液Ⅲ可以从这种树脂上洗掉吸附的杂蛋白。(c)缓冲液Ⅳ通过把这种洗脱液的PH降低到接近AHF的等电点，从而选择性地减弱AHF与树脂的结合这种方法，为AHF的洗脱作准备。但是为了防止这种缓冲液引起AHF和树脂结合键的破坏(和AHF的提前洗脱)，溶剂的离子强度也同时降低。(d)缓冲液Ⅴ含有(ⅰ)一种高盐浓度的缓冲，以保证所有蛋白处于一个适当的PH环境中;(ⅱ)钙离子，用于洗脱这种蛋白质，并破坏AHF和混杂的维勒布兰德因子之间的非共价键;(ⅲ)甘油用于稳定AHF蛋白(因为该缓冲液中去掉了糖，以促进AHF蛋白从树脂上的解吸附作用;(ⅳ)吐温-80，用于帮助消除AHF蛋白与凝胶载体的非特异性结合。氨基己基-琼脂糖树脂柱用于从混杂的亲水性蛋白中纯化AHF。通常这种树脂通过疏水性的相互作用与蛋白结合，而该树脂上的氨基则是通过静电相互作用，结合蛋白质。为这种层析柱选择实验步骤和材料的理由如下(a)缓冲液Ⅵ含中等量的盐以洗脱结合弱的蛋白。(b)缓冲液Ⅶ含较高量的盐，以洗脱结合较紧的蛋白。(c)缓冲液Ⅷ提供了洗脱的PH，以使许多蛋白离子化，从而将它们从这种柱上洗脱下来。虽然在这一PH下，AHF的电荷是增加的，但它仍保持与这种层析柱的结合，尽管这种结合较为松驰。此缓冲液Ⅸ用于洗脱AHF蛋白。较高盐浓度的液使PH发生改变。钙提供了一种洗脱用的平衡离子，并破坏AHF与可能仍然存在的维勒布兰德因子之间的非公价键。山梨醇增加了AHF对这种层析柱的离子的相互作用，减少了AHF对这种层析柱的疏水性的相互作用。吐温-80有助于消除AHF蛋白对这种凝胶的疏水性和非特异性的结合，从而进一步提高产率。如上所述，上面报告的方法只是本发明中的一个优选的实施方案。正如该方案所阐述的那样，单独用阴离子交换层析柱或单独用疏水的亲和层析柱均可获得高质量的纯化的AHF蛋白。像对这种纯化方法熟练程度一般的人容易领会的那样，可以对此技术作许多改进而不会影响分离的质量，现将许多这样的改良法透露如下(a)可以用其它已知的方法，如可应用于QAE柱的亲水性多聚物(例如聚乙二醇)(以每毫升蛋白用约4-10mg的量)，制备AHF粗提物。(b)冷沉淀物能重新溶解在PH范围5.0～9.0(虽然6.4～7.8更好，而7.0为最适PH)的任何适当的缓冲液中，氢氧化铝并不需要，各种生理性盐类中之任一种可用于该缓冲液中。(c)1～6%的聚乙二醇(PEG)能用于沉淀纤维蛋白元蛋白，但只有当这种冷沉淀物浓度大于6mg蛋白/ml溶液时，这一步骤才具有重要性。另一方面，其它亲水性多聚物，或肝素也可用作纤维蛋白元/纤维结合素沉淀剂。(d)从任何制造厂购得的阴离子交换树脂或疏水性亲和树脂均可使用。虽然某些具有与本发明所用的树脂不同电荷密度，疏水性和基质的树脂需要稍微调正缓冲液，但这种缓冲液的更换可以由一个对本技术熟悉的人员容易地完成。而且这种缓冲液的更改一般都包括在制造商的说明书中。顺丁烯二酸酐多聚电介质层析可以代替疏水性的亲和层析法。而且，在阴离子交换层析柱后再用疏水性亲和层析柱进行分离纯化，并不是必须的。其它的离子交换柱或其它部分地疏水的层析柱(包括但不是仅限于顺丁烯二酸酐多聚电介质)都可以用来纯化AHF蛋白。此外，如上所述，如果愿意的话，一个类型的层析柱(离子交换，多聚电介质或疏水性亲和柱)可以只使用一次。(e)AHF蛋白与膨胀了的QAE凝胶的比例可以80∶1到0.5∶1，虽然适宜的范围是5∶1到0.5∶1以及最适范围是3∶1到0.5∶1。(f)各种不同直径的层析柱可以使用，柱的宽∶长比值可从1∶100～100∶1，虽然适宜的范围是1∶1～5∶1，以及最适范围是2∶1。对本技术熟练的人会体会到，不同管径大小的层析柱可以改变分辨率，必须相应地调整缓冲浓度和洗脱液体积。(g)除层析柱容量外，对流速并无限制。但是，流速慢可以获得较大的分辨力。(h)缓冲液Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ全都用来洗涤并不是绝对必要的。此外，所用的每种缓冲液的量是可以改变的。对缓冲液Ⅱ来说，其工作范围是0-10倍(或更多)于柱床体积，优选范围为2-5倍于柱床体积，最佳用量为柱体积的2倍。对缓冲液Ⅲ来说，其有效用量范围为0-10倍(或更多)于柱床体积。优选用量范围为柱床体积的3-6倍，最佳用量为柱床体积的5倍;对缓冲液Ⅳ来说，其有效用量范围为柱床体积的0-10倍，优选用量为柱床体积的2倍。(i)可以对缓冲液Ⅴ作许多改动而不会明显减弱它的洗脱效果。该缓冲液的有效PH范围是4-9，优选范围为5.9-6.5，最适PH为6.0(该PH对AHF蛋白的稳定性是可靠的，但它较接近于AHF的等电点)。至于特定的缓冲液浓度并没有限定，虽然其优选范围是0.02～2.0M，最佳浓度是0.35M。对平衡离子，除了其浓度最在好在0.02～2M范围内，以及二价离子的最佳浓度为0.35M，单价离子的最佳浓度为1M外，其种类并无限制。任何水溶液醇，或多元醇，或水溶性有机溶剂都可使用，虽然它们并不是绝对需要的，用量为0.05～15%的乙醇为优选溶剂，其最佳用量为1%，任何离子型的和非离子型的洗涤剂或者表面活性剂都可以使用，虽然它们并不是必要的。关于吐温-80，其有效用量范围为0～50%，其优选范围为0.001～0.2%，其最佳用量为0.025%。(j)水合作用添加剂浓度随所用的添加剂不同而不同。(k)适合于非肠道给药的其它生理缓冲液，也可在上面指定的PH和离子强度范围内应用(完全按照本纯化技术内规定的应用)。(l)为了获得最佳的AHF产率，纯度和分辨力，确定糖、多元醇、氨基酸或盐(水合作用添加剂)的用量是必须的。尽管某些糖和醇在AHF纯化中的应用来说，通过反复试验，已经确定了其起始用量。鉴于AHF纯品(确实是以能取得优选水合作用数据的AHF量)实际上未能得到，根据Gekko，K.和Morikawa，T.(见上面所引文献)提供的资料，可以把在不同浓度的水合作用添加剂水溶液条件下得到的牛血清白蛋白(BSA)的优选水合作用相联系。现将Gekko和Morikawa的资料复制如下表Ⅰ在水溶性多元醇系统(25℃)中牛血清白蛋白与溶剂的偏微分比容积和优选相互作用参数 a.每克水中乙醇克数。b.1千克水中每摩尔蛋白每摩尔乙醇的热卡值。表Ⅲ 在葡萄糖水溶液中蛋白质与溶剂的优选相互作用参数 表Ⅲ BSA与氨基酸的优选相互作用参数蛋白质与氨基酸的作用 表Ⅰ 相互作用参数 表Ⅱ 在乳糖水溶液中几种蛋白质的偏微分比容和优选相互作用参数 一个对本技术一般熟练的人，通过使用能使牛血清白蛋白产生0.23优选水合作用值的若干浓度的各种水合作用添加剂，就能获得希望纯化的蛋白(在本文情况下，是AHF蛋白)的产率和纯度的层析分析数据。利用BSA在含各种糖的溶液中的水合作用数据，作了如下观察当BSA的优先水合作用值对在不同浓度的各种糖、多元醇存在下的冷沉淀物层析分离得到的AHF产率和纯度作图时，可以发现，在能产生0.22～0.24g H2O/g BSA的BSA优选水合作用的相当窄的糖浓度范围内，AHF的产率(图1)和纯度(图2)为最大。在能产生高于或低于此值的BSA优选水合作用的糖浓度下，所纯化的AHF的纯度都是比较低的。1M山梨醇选为纯化AHF的最佳浓度。任何能优选水合AHF的水合作用添加物量都可使用，虽然已经发现能使BSA水合达0.23克水/克BSA的水合作用添加物用量为最佳用量。所用的水合作用添加剂不必是山梨醇，虽然它是优选的。能应用的糖(不仅用于AHF，而且也可用于其它蛋白)有蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、松三糖、葡聚糖、木糖、阿洛糖、6-脱氧甘露糖、6-脱氧半乳糖等。最好用人工方法使糖降解，以省去进一步的纯化步骤，这应该是可能的。AHF纯化用的优选糖是葡萄糖和麦芽糖。用于AHF纯化的优选的糖浓度范围是蔗糖 0.5-2.0 M，以1.0M为最好;乳糖 0.0-0.4，以0.25M为最好;麦芽糖0.2-0.4，以0.3M为最好;葡萄糖0.5-2.0 M，以1.0M为最好。另一方面，多元醇、氨基酸或盐也能用。一般而言，合适的多元醇是山梨醇、甘露醇、肌醇、核糖醇、赤藓醇、乙二醇、木糖醇、丙二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、聚蔗糖(一种合成的蔗糖多聚物)和核糖醇，其中以山梨醇为最好。AHF层析分离中山梨醇的优选浓度范围是0.5～2.0M，以1.0M为最好。适宜的氨基酸有甘氨酸，β-丙氨酸、β-丙氨酸，以及更好的甜菜碱。适宜的盐有醋酸钠、醋酸钾、氯化钠、硫酸钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、硫氰酸钾等。各种糖、醇、氨基酸和盐的优先水合作用参数可以从上面引用的Timasheff等的几篇论文中得到，或根据他们的方法经验地加以测定。前面的参考文献透露了使用多种溶剂的各种蛋白质的优选相互作用或优选水合作用(下面给出这两个术语的定义)值和测定优选水合作用的方法。这些论文所透露的水合作用值和水合作用添加剂的浓度复制如下由于Lee等和Arakawa等(文献见前面)所报告的方法是一种复杂的操作，而且需要一名高级的生理化学专家，因此，也许可以通过查明过去这些研究在牛白蛋白系统或其它蛋白系统中，是否已用过这种添加剂，确定达到希望的优选相互作用或优选水合作用所需要的该添加剂的大约浓度。正如上面指出的那样，对AHF纯化来说，BSA可作为样板。有人发现，能优选地使蛋白水合到约0.22-0.24(克水)/(克BSA)水平的添加剂的量是用于AHF层析的最佳添加剂用量。在从上面的表列数据查得水合作用值后，还有一点是重要的，即通过改变层析分离期间所用的添加剂的量(在由白蛋白的优选水合作用所指示的那个浓度的适中范围内)确定对所...
【专利技术属性】
技术研发人员：里塔怀特马修斯，阿兰J约翰森，
申请(专利权)人：纽约大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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