本发明专利技术公开了一种刺激肝细胞ＤＮＡ合成的生物药品肝肽素的纯化和部分氨基酸序列。本发明专利技术采用反向Ｃ↓［４］－高效液相色谱进行纯化，固相蛋白质顺序分析仪测氨基酸序列。本发明专利技术能刺激肝细胞ＤＮＡ的合成，对慢性活动乙型肝炎能明显抑制谷丙转氨酶的活性，降低血性总胆红素，升高Ａ／Ｇ比值，有效地促进肝功能的恢复。治疗慢性肝炎的有效率为９４. ３％，肝硬化的有效率为８２. ８％，重症肝炎的有效率为８１. ９％。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种刺激肝细胞DNA合成的生物药品肝肽素的纯化和部分氨基酸序列。近年来，国内外广大学者对肝病的治疗，愈来愈注重选用对肝细胞的再生药物，其来源和制备方法各不相同。最早LaBrecque从大鼠再生肝中提取“肝刺激物质”(Hepatic stimulator substamce，HSS)，Nakamura从血小板中提取“肝细胞生长因子”(Hepatocyte Growth Factor，HGF)。国内陈光明等从乳猪肝中提取HGF，苏先狮等用改良的Labrecque方法从乳猪肝中提取刺激生长因子即肝肽素粗品，并于1991年申请了中国专利。本专利技术的目的是提供肝肽素粗品的进一步纯化和部分氨基酸序列。本专利技术是将肝肽素粗品的冻干品，采用反向C4-高效液相色谱进行纯化，色谱柱为Delta PackC4300A(3.9mm×30cm)层柱温度42℃，流速0.7m/min。第一次纯化时检测波长280nm和230nm，洗脱液A0.1%TFA水溶液;B100%乙腈(含0.1%TFA)洗脱梯度0～30分钟，乙腈线梯度0～75%;30～35分钟，保持75%乙腈，35～40分钟，乙腈线性梯度为75～0%。第二次样品纯化时，检测波长280nm流动相A0.1%TFA水溶液;B100%乙腈(含0.1%TFA)洗脱梯度0～25分钟，乙腈线性梯度0～75%，25～30分钟，75%乙腈保持5分钟，30～35分钟，乙腈75%～0%。纯化后的肝肽素，其分子量为2.1万道尔顿，对42℃30分耐热，对酸碱稳定，经Milligen 6600型固相蛋白质顺序分析仪测得N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Asp-Glu-Lys-Ser-Phe-Lye-Trp-Lys-Ala-Thr。本专利技术能刺激肝细胞DNA的合成，对慢性活动性乙型肝炎，能明显抑制谷丙转氨酶的活性，降低血清总胆红素，升高A/G比值，有效地促进肝功能的恢复。并能抑制血清肿瘤坏死因子(STNF)水平及外周血单个核细胞诱导的肿瘤坏死因子(PBMC-TNF)，具有一定的免疫调节作用。治疗慢性肝炎的有效率94.3%，肝硬化的有效率82.8%，重症肝炎的存活率81.9%。附附图说明图1第一次纯化反向C4-HPLC图谱附图2第二次纯化反向C4-HPLC图谱附图3氨基酸序列图谱实施例1120ug，肝肽素粗品的冻干品，溶于100微升0.1%TFA水溶液中，色谱柱为Delta Pack C4300A(3.9mm×30mm)，层柱温度42℃，流速0.7ml/min，检测波长280nm和230nm，洗脱液A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈(含0.1%TFA)，洗脱梯度0～30分钟乙腈线性梯度0～75%，30～35分钟，保持75%乙腈，35～40分钟乙腈线性梯度为75%～0%。(图谱见附图1)实施例2将第一次反向C4-HPLC的肝肽素组份(附图1中的B组份)4ml冻干，溶于100微升0.1%TFA水溶液，色谱柱Delta Pack C4300A(3.9mm×30cm)，层析温度42℃，流速0.7ml/min，检测波长280nm，流动相A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈(含0.1%TFA)洗脱梯度0～25分钟，乙腈线性梯度0～75%，25～30分钟75%乙腈保持5分钟，30～35分钟乙腈75%～0%。(图谱见附图2)权利要求1.肝肽素的纯化，其特征在于将粗制的肝肽素冻干品采用反向C4-高效液相色谱进行纯化，色谱柱为Delta Pack C4300A，层柱温度42℃，流速0.7m/min。2.纯化后的肝肽素的部分氨基酸序列，其特征在于N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Asp-Glu-Lys-Ser-Phe-Lys-Trp-Lys-Ala-Thr。3.根据权利要求1所述肝肽素的纯化，其特征在于第一次纯化的检测波长为280nm和230nm，洗脱液A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈，洗脱梯度0～30分钟乙腈线性梯度0～75%，30～35分钟保持75%乙腈，35～40分钟乙腈线性梯度为75%～0%。4.根据权利要求1所述肝肽素的纯化，其特征在于第二次纯化检测波长280nm，流动相A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈，洗脱梯度0～25分钟乙腈线性梯度0～75%，25～30分钟乙腈保持5分钟，30～35分钟乙腈75%～0%。全文摘要本专利技术公开了一种刺激肝细胞DNA合成的生物药品肝肽素的纯化和部分氨基酸序列。本专利技术采用反向C文档编号C07K7/06GK1100427SQ9311169公开日1995年3月22日 申请日期1993年9月13日 优先权日1993年9月13日专利技术者苏先狮, 邓纯, 王谷丰 申请人:湖南医科大学附二院医药技术开发公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
肝肽素的纯化，其特征在于将粗制的肝肽素冻干品采用反向Ｃ↓［４］－高效液相色谱进行纯化，色谱柱为Ｄｅｌｔａ ＰａｃｋＣ↓［４］３００Ａ，层柱温度４２℃，流速０. ７ｍ／ｍｉｎ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏先狮，邓纯，王谷丰，
申请(专利权)人：湖南医科大学附二院医药技术开发公司，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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