新的DNA分子制造技术

一种分离的多肽，其为结核分支杆菌ＲＮＡ聚合酶组Ⅰδ亚单位，或为其功能相当的修饰形式。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供编码结核分支杆菌RNA聚合酶δ亚单位的新的核酸分子。它也涉及这种核酸分子编码的称为SigA和SigB多肽，以及载体和用该核酸分子转化的宿主细胞。本专利技术进一步提供了抑制δ亚单位和核心RNA聚合酶之间相互作用的化合物的筛选方法。
技术介绍
基因转录成相应的RNA分子是一个复杂的过程，它由DNA依赖性RNA聚合酶催化，并涉及许多不同的蛋白因子。在真细菌中，核心RNA聚合酶由比例为2∶1∶1的α，β和β′亚单位组成。为了指导RNA聚合酶到待转录的特异基因的启动子，细菌产生多种称为δ因子的蛋白，其与RNA聚合酶相互作用以形成有活性的全酶。所产生的复合物能识别和附着到启动子中特异的核苷酸序列。物理学测量表明δ亚单位结合至核心RNA聚合酶时诱导其构型转变。δ亚单位结合到核心酶，增加核心酶对DNA结合常数的好几个数量级。(Chamberlin，M.J.(1974)生物化学综述年刊43，721-)。根据鉴定和测序不同生物来源的δ亚单位的特征描述将它们分为两大类组I和组II。组Iδ也称为δ70类或“管家”δ组。属于该组的δ亚单位识别细胞中的相似启动子序列。这些特性反映在种间是高度保守的蛋白质的某些区域中。细菌δ因子与真核细胞的转录因子没有任何同源性，因而是抗菌化合物的潜在的靶子。δ亚单位的突变，影响了它的结合及赋予DNA序列对酶特异性的能力，已知其对细胞而言是致死性的。结核分支杆菌是主要的肺部致病菌，它的特征是生长速度很慢。作为一种致病菌，它进入肺泡的巨噬细胞，在其吞噬体内增殖，最终裂解细胞，经血液不仅传播至肺的其它区域，而且至肺外组织。因此病原菌在至少两种完全不同的环境增殖，涉及利用不同营养物质和多种可能的宿主因子；一种成功的感染涉及新的多套基因协调表达。这种调节类似不同的生理阶段，以芽孢杆菌属为最好例证，其不同阶段特异的基因表达通过RNA聚合酶与不同δ因子结合而被转录。这提供了不仅定向结核分支杆菌的看家δ的可能性，而且定向不同感染和传播阶段的特异的δ亚单位的可能性。附图简述附图说明图1质粒pARC 8175图谱图2质粒pARC 8176图谱专利技术目的由于与特异性δ亚单位的结合对RNA聚合酶的特异性来说是至关重要的，因此该相关过程是药物设计的适宜靶子。为了鉴定能抑制上述相关过程的化合物，鉴定δ亚单位的一级结构是必要的。因此本研究的目的在于提供δ亚单位的序列和结构的信息，此信息将能够筛选、鉴定和设计能与δ亚单位竞争结合核心RNA聚合酶的化合物，这些化合物可开发为有效的治疗制剂。专利技术公开贯穿本描述，特别是在以下的实施例中，术语“标准方案”和“标准步骤”当用于上下文分子克隆技术时，应理解为是通常能在普通实验室手册中查到的方案和步骤，如Sambrook J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T(1989)分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。第一方面本专利技术提供了结构分支杆菌RNA聚合酶的组Iδ亚单位的分离的多肽，或其有功能的等价修饰形式。优选的具有根据序列表中SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的这种多肽经重组DNA技术获得，且在下文称为SigA和SigB多肽，然而应该明确的是根据本专利技术多肽并不严格局限于具有与序列表内SEQ IDNO2或4相同的氨基酸序列的多肽。更有甚者本专利技术另外包括这些带有修饰的天然多肽的修饰形式，如替代、小的缺失、插入或倒位，然而这些多肽基本上有结核分支杆菌δ亚单位的生物活性。这些生物活性包括与核心酶结合和/或赋予启动子序列识别以及转录起始特性的能力。因而，包括在本专利技术中的有多肽，其氨基酸序列与列于序列表中SEQ IDNO2或4的氨基酸序列至少90％同源，优选至少有95％同源。另一方面本专利技术提供分离和纯化的核酸分子，其具有编码本专利技术的多肽即SigA或SigB多肽的核苷酸序列。在本专利技术的优选形式中，上述核酸分子为DNA分子，其具有与序列表中SEQ ID NO1或3相同的核苷酸序列。然而，根据本专利技术的核酸分子并不严格局限于具有SEQID NO1或3所示序列的DNA分子。更有甚者，本专利技术包括带有修饰的核酸分子，如替代、小的缺失、插入或倒位，然而其编码基本具有根据本专利技术多肽的生物化学活性的蛋白。因此包括在本专利技术中有DNA分子，其核苷酸序列与列于序列表中SEQ ID NO1或3的核苷酸序列具有至少90％的同源性，优选至少95％的同源性。包括在本专利技术中也有这类DNA分子，其核苷酸序列因遗传编码简并而成为SEQ ID NO1或3的核苷酸序列。三个核苷酸的序列组即为一个密码子，编码一个氨基酸。因有64个可能的密码子，但仅有20个天然氨基酸，故大多数氨基酸由多个密码子所编码。遗传密码子的这种天然的简并性或丰余性在本领域中众所周知。因此应理解序列表中所显示的DNA序列，仅是大量但又确定的编码上述多肽DNA序列中的一个实例。本专利技术因此包括选自下列来源的分离的核酸分子(a)包括在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中显示的编码结核分支杆菌RNA聚合酶组Iδ亚单位的核苷酸序列的DNA分子；(b)核酸分子，其包括能与(a)中定义的DNA分子多肽编码区互补的核苷酸序列杂交的并且编码结核分支杆菌组Iδ亚单位的多肽的核苷酸序列或其有功能的等价修饰形式；(c)核酸分子，其包括由于遗传编码的简并而成为(a)或(b)中定义的核苷酸序列并且编码结核分支杆菌组Iδ亚单位的核酸序列或其有功能的等价修饰形式。术语“与核苷酸序列的杂交”应理解为在本领域的技术人员熟知的严格条件下杂交到一段核苷酸序列或其特异性部分。本专利技术的DNA分子可以是载体形式如可复制的表达载体，它能携带和介导根据本专利技术的DNA分子的表达。本文中“复制”意指该载体能在其被导入的给定类型宿主细胞中复制。载体的实例是病毒，例如嗜菌体、粘粒、质粒和其它重组载体。用本领域众所周知的方法将核酸分子插入载体基因组。根据本专利技术载体包括质粒载体含有SigA基因的编码序列pARC 8175(NCIMB 40738)或含SigB基因编码序列的pARC 8176(NCIMB 40739)。包含根据本专利技术载体的宿主细胞也包括在本专利技术之中。这种宿主细胞可以是原核细胞、单细胞的真核细胞或来自多细胞生物的细胞。因此宿主细胞可以是，如细菌如大肠杆菌细胞；来自酵母的细胞如啤酒糖酵母或巴斯德毕赤酵母；或哺乳动物细胞。载体有效地导入宿主细胞使用的方法是众所周知的标准方法即重组DNA方法。本专利技术更进一步的方面是关于本专利技术多肽的制备方法，包括在所述多肽产生的情况下培养以根据本专利技术的表达载体转化的宿主细胞及回收该多肽。用于培养细胞的培养基可以是适合此目的任何常规培养基。适宜的载体可以是上述任何载体，且合适的宿主细胞可以是上面已列出的任何类型细胞。构建载体和有效将其导入宿主细胞使用的方法可以是在重组DNA领域中用于此目的已知的任何方法。依据细胞的类型和载体的组成，细胞表达的重组多肽能够分泌即经细胞膜输出。若该多肽由宿主细胞在细胞内产生即不由细胞分泌，于是可用标准步骤回收，包括机械法使细胞裂解，例如超声粉碎或匀浆，或通过酶或化学法，其后纯化。为达到分泌的目的，编码多肽的DNA序列应接上编码信号肽的序列，信号肽的存在方可保证多肽由细胞分泌出来，从而至少表达多肽的重要部本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：M·巴加内，U·沙尔马，
申请(专利权)人：阿斯特拉公司，
类型：发明
国别省市：