枯草芽孢杆菌YBM-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用制造技术

一株枯草芽孢杆菌YBM‑4，分类名为Bacillus subtilis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月15日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12355。该菌株具有以下优势：(1)生防效果好：在盆栽试验中，用YBM‑4菌液处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果达到84.33％，显著优于58％甲霜·锰锌和生物制剂枯草芽孢杆菌的防治效果，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。(2)促生效果好：YBM‑4菌液烟株的生物量及农艺性状均具有显著的促进效果，与对照组差异显著。

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌YBM-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用
本专利技术属于生物防治
，具体涉及一株枯草芽孢杆菌YBM-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用。
技术介绍
烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是一种兼性寄生菌，对烟草具有毁灭性危害。黑胫病菌喜高温高湿，温度在28-30℃，湿度达到80％以上时，会给病菌孢子囊的释放和游动孢子的传播创造有利条件，此时最易引起烟草黑胫病的流行与发生，引起烟株大面积死亡。烟草作为其寄主植物，在其团棵期到旺长期间发病达到高峰期，主要危害烟株根部和茎基部。另外，土地多年连作、与烟草青枯病、根结线虫病混合发生，将加重危害烟株健康，导致烟叶减产、品质降低。土壤中主要含有细菌、真菌和放线菌3类微生物，研究发现许多芽孢杆菌作为拮抗菌对烟草黑胫病具有良好的防治效果。国内外众多研究表明，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)等通过抗生、溶菌、竞争、重寄生等作用机制对烟草黑胫病具有良好的防治效果。有些拮抗菌对烟株有促生作用，促进烟苗氮、磷、钾吸收，可有效降低带病烟苗的发病率和病情指数。拮抗菌的应用和发展是生物防治的一种重要手段和方法，其中芽孢杆菌具有分布广、抵抗力强等特点。杨桃等分离出一株枯草芽孢杆菌Itb57，可有效降低霉菌细胞壁主要成分β-1,3-葡聚糖含量及其合成酶的活性，减少DNA的含量，从而抑制疫霉菌丝的生长。王进等发现枯草芽孢杆菌21b对对烟草黑胫病菌的抑制率达78.33％，同时对烟草青枯病菌、灰霉病菌、赤星病菌和炭疽病菌也具有拮抗作用。曾衡筛选出3株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，可高效拮抗烟草黑胫病菌，具有较强的定殖能力，有效增加烟叶的产量。王静等分离出一株短小芽孢杆菌AR03，对烟草黑胫病和青枯病有明显的拮抗作用，且混合72％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂时，防治效果更好。目前也有商品化的枯草芽孢杆菌，但是在防治烟草黑胫病及促生长方面仍有不足。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提供一株枯草芽孢杆菌，能有效防治烟草的黑胫病，并能对烟草的生长产生明显的促进作用。一株枯草芽孢杆菌YBM-4，分类名为Bacillussubtilis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月15日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12355。进一步地，枯草芽孢杆菌YBM-4的菌体呈杆状，革兰氏染色显阳性。进一步地，所述枯草芽孢杆菌YBM-4的培养基组份为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L。进一步地，所述枯草芽孢杆菌YBM-4的培养条件为：30-35℃、pH7-8恒温震荡培养24-72h。优选32.5℃、pH7.5恒温震荡培养48h。上述枯草芽孢杆菌YBM-4在防治烟草黑胫病中的应用。进一步地，枯草芽孢杆菌YBM-4在防治烟草黑胫病中应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×107-9×107cfu。更进一步地，灌根采用分三次灌根的形式，第一次在烟株生长到5-6片真叶时，以后每隔7天灌根一次。更进一步地，三次灌根量相同。上述枯草芽孢杆菌YBM-4在促进烟草生长中的应用。进一步地，枯草芽孢杆菌YBM-4在促进烟草生长中应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×107-9×107cfu。更进一步地，为使拮抗菌更好地定植在烟株的根部，烟苗在移栽至生长田中前在1×106-9×106cfu/mL的YBM-4菌液中浸根20-40min。本专利技术从烟草根际土壤中分离筛选到1株对烟草黑胫病菌具有较好拮抗活性，且对烟株具有良好促生作用的枯草芽孢杆菌YBM-4，具有以下优势：(1)生防效果好：在盆栽试验中，用YBM-4菌液处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果达到84.33％，显著优于58％甲霜·锰锌和生物制剂枯草芽孢杆菌的防治效果，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。(2)促生效果好：YBM-4菌液对烟株的生物量及农艺性状均具有显著的促进效果，与对照组差异显著。附图说明图1拮抗菌YBM-4对烟草黑胫病菌的抑制作用(A为对照、B为YBM-4菌株)；图2在扫描电子显微镜下，YBM-4拮抗菌的形态结构；图3温度对YBM-4菌株生长量的影响；图4pH对YBM-4菌株生长量的影响；图5培养时间对YBM-4菌株生长量的影响。图6拮抗菌YBM-4的16SrDNA序列系统发育树；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YBM-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年4月15日，保藏编号为CGMCCNo.12355。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步详细说明。所有实施例中用到的材料如下：主要试剂和材料如下：DNA快速提取试剂盒EasyPureBacteriaGenomicDNAKit为全式金生物技术有限公司产品(货号EE161-01)；革兰氏染色试剂盒为索莱宝产品(货号G1060)；58％甲霜·锰锌可湿性粉剂为江苏灵宝化学有限公司生产；枯草芽孢杆菌可湿性粉剂由德强生物公司生产；其他药剂均为国药分析纯。烟草品种：红花大金元(易感品种)，由国家烟草改良中心提供。烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)：由国家烟草改良中心提供。拮抗菌分离、培养和测定所用的培养基如下：拮抗菌的培养和分离选用营养琼脂培养基NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)，和营养肉汤培养基NB(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L)。抑菌活性测定选用燕麦培养基OA(燕麦片18g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。生理生化性状测定选用运动型培养基(明胶80g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂4g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。柠檬酸盐利用情况选用柠檬酸盐琼脂培养基(MgSO4·7H2O0.2g，NH4H2PO41g，K2HPO4，柠檬酸钠2g，溴麝香草酚蓝80mg，琼脂15g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。厌氧生长情况选用葡萄糖肉汤培养基(营养肉汤8g，20％葡萄糖贮液50mL，蒸馏水950mL，调节pH7.0)。实施例1枯草芽孢杆菌YBM-4的筛选及其对黑胫病菌的拮抗作用1.1拮抗菌的分离和筛选：从贵州开阳、清镇，四川攀枝花、西昌，山东诸城、沂水、即墨等地共采集土壤87份，为获得高效拮抗菌，选取5-10cm深处的黑胫病株根部土壤及相邻健康植株根部土壤，做好标记后，保存于-20℃的冰箱中待用。对采集的87份土壤分别进行以下处理：首先将土壤中的根、茎、叶等杂物除去，进行压碎过20目筛。用电子天平称取5g处理后的土壤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株枯草芽孢杆菌YBM‑4，分类名为Bacillus subtilis，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月15日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12355。

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌YBM-4，分类名为Bacillussubtilis，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月15日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12355。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YBM-4，其特征在于，枯草芽孢杆菌YBM-4的菌体呈杆状，革兰氏染色显阳性。3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YBM-4，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YBM-4的培养基组份为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L。4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌YBM-4，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YBM-4的培养条件为：30-35℃、pH7-8恒温震荡培...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖丽娜，陈德鑫，李锡宏，黎妍妍，徐同伟，廖勇，邓兆权，任春燕，胡兴，李余江，
申请(专利权)人：贵州省烟草公司贵阳市公司，中国农业科学院烟草研究所，湖北省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州,52