本发明专利技术公开了一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，是选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术。本发明专利技术提供的方法聚合了烟草普通花叶病和黑胫病的抗性，获得了双抗种质资源，与传统杂交育种方法相比，可以明显减轻育种的工作强度、缩短育种的周期，具有效率高、选育周期短的优点；选育的品种虽然农艺性状离生产应用还有差距，但创建的聚合抗性种质与常规栽培推广的品种可以实现正常杂交，可用于优良品种的抗性改良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于烟草育种
，具体涉及一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法。
技术介绍
烟草母本起源单倍体育种是栽培烟草（母本）与非洲烟（Nicotiana africana）（父本）杂交产生的母本起源的单倍体（Burk L. G., Wernsman D. U. 1979. Maternal Haploids of Nicotiana tabacum L. from Seed. Science. 206:585.）。这些F1 种子播种后，只有孤雌生殖的烟苗和少数混倍体存活下来，那些腺毛密度小、叶片薄圆的烟苗即为单倍体。处于绝对领先地位的美国在烟草母本起源单倍体育种新技术实践中得到了广泛使用，选育出NC2000、NC71等优良品种。因此，在单基因控制的显性抗烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus TMV）基因 N（Lewi et al. 2005. Molecular and Genetic Characterization of Nicotiana tabacum L. Chromosome Segments in Resistant Tobacco Accessions. Crop Science. 45:2355.）和来源于N.plumbaginifolia的单基因控制的显性抗黑胫病（Phytophthora nicotianae）基因PhP（Johnson et al.2002. Marker-Assisted Selection for Resistance to Black Shank Disease in Tobacco. Plant Disease. 86:1303-1309.）等单抗烟草栽培品种成功选育的基础上，采用母本来源单倍体育种技术，为双抗烟草普通花叶病和黑胫病种质资源的创建提供了可能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法。本专利技术的目的是这样实现的，选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：A、杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料；B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；D、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种获得的种子即可作为种质资源进行保存。本专利技术采用杂交聚合抗性、母本来源单倍体育种技术、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的方法创建新种质。先将抗黑胫病的Coker371与抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176进行杂交；以获得的杂种材料为母本，以非洲烟（Nicotiana africana）为父本，进行远缘杂交；将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗，待长出3片真叶后选择叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的幼苗即为单倍体烟苗；再选择有抗TMV的N基因及抗黑胫病的PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体植株；选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定验证，即获得兼抗这两种病害的加倍单倍体植株，常规繁种获得的种子就可作为种质资源进行保存。本方法不仅具有效率高、选育周期短的优点，而且创建的聚合抗性种质可用于优良品种的抗性改良。本专利技术具有以下优点及效果：1、本专利技术提供的方法聚合了烟草普通花叶病和黑胫病的抗性，获得了双抗种质资源，与传统杂交育种方法相比，可以明显减轻育种的工作强度、缩短育种的周期，具有效率高、选育周期短的优点。2、选育的品种虽然农艺性状离生产应用还有差距，但创建的聚合抗性种质与常规栽培推广的品种可以实现正常杂交，可用于优良品种的抗性改良。附图说明图1为聚合双抗烟草普通花叶病和黑胫病种质资源的选育过程示意图；图2为Coker371×Coker176双抗杂交种与非洲烟杂交获得单倍体材料，其中，a为目标单倍体材料，b为单倍体现蕾，c为二倍体与单倍体花器比较；图3为Coker371× Coker176双抗单倍体分子标记筛选；其中：a为M 100bp 标准分子量，1 为Coker176，2为F1杂交种，3-7 为单倍体植株（H1,H3,H4,H7,H8），8为红大；b为M 100bp 标准分子量，1为红大，2为Coker371，3为 F1杂交种，4-8 为单倍体植株（H1,H3,H6,H7,H8）；图4为双抗单倍体组培加倍，其中a为外植体材料, b为外植体丛生芽萌发，c为目标丛生芽筛选，d为加倍单倍体；图5为双抗单倍体组培加倍材料TMV及黑胫病常规抗性接种鉴定，其中a为TMV抗性鉴定鉴定， 1为 RBST，2为红大；b 黑胫病抗性鉴定，1为RBST，2为红大；图6为双抗单倍体组培加倍材料TMV及黑胫病抗性相关分子标记分析，其中，a 为抗黑胫病PhP基因RAPD分析M 100 bp标准，1为红大 2-3 为RBST，4-5为 Coker371，6为Coker176，7为H2O；b 抗TMV的N基因电泳分析M 100 bp 标准，1为红大 2-3为 RBST，4为Coker176，5-6为 Coker371，7为H2O。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，是选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：A、杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料；B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：A、杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料；B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；D、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种获得的种子即可作为种质资源进行保存。
【技术特征摘要】
1.一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：
A、杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料；
B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；
C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；
D、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫...
【专利技术属性】
技术研发人员：李永平，陈学军，肖炳光，焦芳婵，方敦煌，刘勇，张谊寒，杨大海，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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