改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素及其制备制造技术

改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素及其应用。内皮抑素通过抑制新生血管的生长，遏制肿瘤生长，达到治疗肿瘤的目的。国内专家孙汶生等构建的内皮抑素基因工程酵母菌，徐根兴教授等构建的内皮抑素双歧杆菌基因工程，都已申请了专利，以上研究都不涉及内皮抑素结构的改变。改变内皮抑素结构、增强其抗肿瘤活性内皮抑素，其组成包括：内皮抑素，运用定点诱变技术通过改变内皮抑素基因的硷基序列，改变内皮抑素的氨基酸序列，将原内皮抑素的第２５－３１位精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸改为精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。用改变结构的内皮抑素治疗肿瘤等疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过改变内皮抑素结构、提高其抗肿瘤活性内皮抑素，以及用改造后的内皮抑素基因构建基因工程菌。
技术介绍
肿瘤是人类病死率最高的疾病之一。目前用于治疗肿瘤的药物根据其作用的靶细胞不同分为两大类。一类是临床上应用的化疗药物，直接抑制、杀灭肿瘤细胞，在破坏肿瘤细胞的同时也同样破坏机体正常细胞，产生明显的毒副作用；另一类药物通过抑制肿瘤组织新生血管的生成，切断肿瘤细胞的营养供应，迫使肿瘤细胞停止生长，甚至死亡。具有抗肿瘤谱广、毒性低和不产生抗药性等优点，已经成为肿瘤药物治疗新的亮点和热点。内皮抑素是目前国际上公认的活性最强的新生血管生成抑制剂，自1997年被发现以来即成为各国科学家争相研究的热点，美国基因重组人的内皮抑素已经完成了一期临床试验。实验结果证实，内皮抑素对多种肿瘤都有明显地抑制、治疗作用，但需要的剂量较大，只有达到20mg/kg时，肿瘤方能退化到初始状态，肿瘤细胞休眠，停止生长。国内已有多家同时进行人内皮抑素的基因工程研究，各家的不同之处是分别选用了不同的表达系统，如大肠杆菌、赤毕酵母菌、哺乳动物细胞等，技术路线和方法大同小异，有的申请了国家专利技术专利，徐根兴教授等将内皮抑素基因导入双歧杆菌、通过口服双歧杆菌来治疗肿瘤，也申请了专利，综上所述，国内外的上述研究都没有涉及内皮抑素分子结构的改变。肿瘤的生长和转移与细胞膜上的整连蛋白(integrin)有关。整连蛋白是细胞膜上的受体，层连蛋白(laminin)通过精氨酸--甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列和整连蛋白结合后可促进肿瘤细胞的生长和转移。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种结构经过改造的内皮抑素及其基因工程菌，其抗肿瘤的活性比原来的内皮抑素提高2～8倍。本专利技术的目的是这样实现的改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素，其组成包括内皮抑素，运用定点诱变技术通过改变所述的内皮抑素基因的硷基序列，改变所述的内皮抑素的氨基酸序列，将原内皮抑素的第25-31位精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸(RGIRGAD)改为精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(RGDRGD)。上述的改变内皮抑素结构、增强其抗肿瘤活性内皮抑素的应用，用所述的改造后的内皮抑素基因构建基因工程菌，从基因工程菌中提取改造后的内皮抑素。本专利技术的优点在于1.内皮抑素是目前已知活性最强的血管生成抑制剂，通过抑制新生血管的生长治疗肿瘤。本专利技术的改变内皮抑素结构、增强其抗肿瘤活性，是通过改变内皮抑素基因中的硷基改变内皮抑素中的氨基酸，即将原内皮抑素的第25-31位精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸(RGIRGAD)改为精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(RGDRGD)，改造后的内皮抑素具有两个连续的RGD序列，与整连蛋白结合的能力大于层连蛋白，在治疗过程中内皮抑素的浓度又远远超过层连蛋白浓度，改造后内皮抑素会和层连蛋白竞争与整连蛋白结合，进而抑制肿瘤的生长和转移，因此改造后的内皮抑素具有双重的抗肿瘤活性，增强了抗癌效果，内皮抑素结构的改造由改造前后基因序列测定图证实(附图1、附图16)。2.利用改造后的内皮抑素基因构建基因工程菌，从基因工程菌中提取重组改造的内皮抑素用于肿瘤的治疗。3.由于改造后内皮抑素的抗肿瘤活性成倍增高，通过体外细胞培养试验、动物体内抑瘤试验等活性检测试验证实，改造后的内皮抑素其抑制新生血管活性、抑制肿瘤细胞转移活性和抗肿瘤活性都成倍地大于内皮抑素，临床上治疗肿瘤时可减少用药量，并可提高疗效，减轻病人的痛苦。4.改造后内皮抑素增强了抑制新生血管生长活性。通过HE染色图片(附图2、附图9、附图10)证实，正常对照组血管内皮细胞生长良好，加入内皮抑素组可见到少量的内皮细胞凋亡区，加入改造后内皮抑素组可见大面积的细胞凋亡区，证明内皮抑素能通过使血管内皮细胞凋亡抑制新生血管的生长，改造后内皮抑素促进血管内皮细胞凋亡的作用又大于内皮抑素。通过微血管试验(MVD)(附图3、附图11、附图12)显示，正常对照组微血管丰富，加内皮抑素组微血管减少，加改造后内皮抑素组微血管明显减少，也证明改造后内皮抑素抑制新生血管生长的活性大于内皮抑素。5.改造后内皮抑素提高抗肿瘤细胞转移活性。通过肿瘤细胞转移试验(附图4、附图13、附图14)显示，加入改造后内皮抑素组的肿瘤细胞转移数明显少于内皮抑素组，证明改造后内皮抑素确实是增强了抗肿瘤转移的活性。6.改造后内皮抑素增强抗肿瘤活性。通过肿瘤细胞体外培养试验，当肿瘤细胞的存活率为0.4时，需要加入的内皮抑素浓度为180，需要加入的改造后内皮抑素为30(附图5、附图15)，改造后内皮抑素的抗肿瘤活性是内皮抑素的6倍；通过裸鼠荷瘤试验，用药一个月时测定，内皮抑素组抑瘤率为40％，改造后内皮抑素组的抑瘤率为51％(见实施例3)，提高了11个百分点，改造后内皮抑素治疗组肿瘤体积明显小于内皮抑素治疗组(附图6)。电镜检查对照组细胞密集排列，形态不规则，细胞间血管丰富，内皮抑素组细胞坏死的数量少，血管发育良好，改造后内皮抑素组部分细胞坏死，核固缩，细胞间有大量细胞碎片，血管明显减少(附图7)。附图说明附图1是测序图(改造后的内皮抑素)。附图2是HE染色图片(改造后的内皮抑素组)。附图3是微血管实验(MVD)图(改造后的内皮抑素组)。附图4是细胞转化实验图片(改造后的内皮抑素组)。附图5是体外细胞培养抑瘤试验图(es野生)。附图6是肿瘤大体实验图片(左图为改造后的内皮抑素，右图为内皮抑素)。附图7是电子显微镜报告单。附图8是内皮抑素结构改造查新报告。附图9是HE染色图片(对照组)。附图10是HE染色图片(内皮抑素组)。附图11是微血管实验(MVD)图(对照组)。附图12是微血管实验(MVD)图(内皮抑素组)。附图13是细胞转化实验图片(对照组)。附图14是细胞转化实验图片(内皮抑素组)。附图15是体外细胞培养抑瘤试验图(es诱导)。附图16是测序图(内皮抑素)。下面结合附图说明具体实施例方式实施例1改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素，其组成包括内皮抑素，运用定点诱变技术通过改变所述的内皮抑素基因的硷基序列，改变所述的内皮抑素的氨基酸序列，提高内皮抑素的抗肿瘤活性，所述的内皮抑素和改造后内皮抑素部分氨基酸序列如下21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32内皮抑素N……S G G MR G I R G A DF……C改造后内皮抑素S G G MR G D R G DF改造后内皮抑素第27位的异亮氨酸(I)换成了天冬氨酸(D)，第30位的丙氨酸(A)被去除，第25-31位间形成两个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)结构，增强了内皮抑素的抗肿瘤活性。实施例2上述的改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素的应用，用所述的改造后的内皮抑素基因构建基因工程菌，从基因工程菌中提取改造后的内皮抑素。实施例3上述的改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素，其裸鼠体内抑瘤试验，三组两两比较如下G＝1(改造后内皮抑素组) G＝2(野生内皮抑素组) G＝3(生理盐水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改变结构、增强抗肿瘤活性的内皮抑素，其组成包括：内皮抑素，其特征是：运用定点诱变技术通过改变所述的内皮抑素基因的硷基序列，改变所述的内皮抑素的氨基酸序列，提高内皮抑素的抗肿瘤活性，所述的内皮抑素和改造后内皮抑素部分氨基酸序列如下：　 　２１２２２３２４２５２６２７２８２９３０３１３２内皮抑素：Ｎ……ＳＧＧＭＲＧＩＲＧＡＤＦ……Ｃ改造后内皮抑素：ＳＧＧＭ ＲＧＤＲＧＤＦ改造后内皮抑素第２７位的异亮氨酸（Ｉ）换成了天冬氨酸（Ｄ），第３０位的丙氨酸（Ａ）被去除，第２５－３１位间形成两个精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（Ｒ－Ｇ－Ｄ）结构，增强了内皮抑素的抗肿瘤活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴汉，王淑静，任明华，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]