具有类甾族化合物结构的物质、其制造方法和含有该物质的抗肿瘤剂技术

本发明专利技术提供一种能够从纯品状态从冬虫夏草中分离出具有抗肿瘤效果的化合物。进而，本发明专利技术查清了上述具有抗肿瘤效果的化合物的化学结构。另外，本发明专利技术的目的是提供含有该化合物的抗肿瘤剂。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从冬虫夏草中分离具有抗肿瘤活性的活性馏分和其中所含活性成分的方法以及该活性成分的化学结构。并且涉及含有该活性馏分或活性成分的抗肿瘤剂。
技术介绍
冬虫夏草是一种子实体，它寄生于蝶蛾类鳞翅目和鞘翅目的昆虫或其幼虫体内，在它们的体内形成菌核，然后在夏季形成于作为宿主的昆虫或其幼虫的虫体表面上。已知在世界上的冬虫夏草约有350种，自古已知，冬虫夏草对人体完全没有毒性并且显示各种各样的效果，因此它是一种可作为中药经口服用的物质，今日在中国已将冬虫夏草录载于作为与中药有关的书刊的“中草药学”或“中药大辞典”等书刊中，即使在日本也已将冬虫夏草记载入“新订和汉药”及其他许多中文书籍中。作为记载于各种书籍中的药理作用，冬虫夏草具有增强精力、滋养强壮、治疗循环器官系统疾病(日本药理学会志，67卷，213页，1995年)、糖尿病、肝病等效果。另外，通过近年来的药理学研究证实，冬虫夏草真菌在许多方面具有活性和药理作用，还报导了它的抗肿瘤和免疫增强作用等。然而，对完全纯化的冬虫夏草的活性成分进行的研究和在临床上应用的例子却很少，因此，在把未经纯化的提取物用于投药时，必须使用较多量的冬虫夏草原未或锭剂，这是存在的问题，另外，在药理作用的均一性和可靠性方面也存在问题。另外，关于从冬虫夏草提取的活性物质的分类或限定以及其药理作用的机制方面的研究几乎未见报导，即使在已被确认具有最多种类冬虫夏草生长的以中国为首的亚洲诸国中，冬虫夏草也是被作为葛根汤等汤剂处方中的药草煎汤服用，只是根据不同地区的习惯和信仰有不同的服用方式，这是目前的现状，在此情况下不能达到确实地维持稳定的药理效果的目的。因此，为了能够确实而且有效地利用冬虫夏草的药理作用，特别是其抗肿瘤和增强免疫力等药理效果，人们强烈地希望开发一种用于从冬虫夏草的成分中分离出具有上述活性的活性成分的分离方法。
技术实现思路
本专利技术着眼于冬虫夏草所具有的抗肿瘤效果，其目的是提供一种能够以纯品状态获得具有上述效果的化合物的分离方法。另外，本专利技术的另一个目的是提供一种具有上述抗肿瘤效果的化合物。进而，本专利技术的再一个目的是提供一种含有上述化合物的抗肿瘤剂。对附图的简单说明附图说明图1A是本专利技术用于从冬虫夏草中提取活性馏分和活性成分的一般流程图。图1B是在实施例1中使用的本专利技术从冬虫夏草中提取活性馏分和活性成分的流程图。图2是色谱图，其中示出了在实施列1中获得的按本专利技术分离纯化的化合物(Ⅱ)的反相色谱。箭头所指处是化合物(Ⅱ)的峰。其中示出的保持时间是以样品注入时间作为0分测得的时间。图3是质谱图，其中示出了在实施例1中获得的作为本专利技术活性成分的化合物(Ⅱ)的质谱数据。图4是表示本专利技术的活性馏分(图1B的C5馏分)对细胞增殖的抑制作用(浓度相关性)的曲线图。图中分别示出了在使用纤维芽细胞(以○表示)和Hela细胞(以●表示)时的结果。图5表示按照本专利技术方法分离、提取的各馏分(图1B的C1～C10馏分)对Vero细胞所起的细胞增殖抑制作用。图6表示按照本专利技术方法分离、提取的各馏分(图1B的C1～C10馏分)对Hela细胞所起的细胞增殖抑制作用。图7是照片，其中示出了DNA碎裂的结果和Hela细胞内的染色质凝聚(24小时)的情况。图8是照片，其中示出了DNA碎裂的结果和Hela细胞内的染色质凝聚(72小时)的情况。图9是表示Hela细胞DNA的电泳结果的照片。其中，泳道1～4表示在24小时之后的结果，泳道5～8表示在48小时后的结果，泳道9～12表示在72小时后的结果。M和数字分别表示分子量标记和标记用分子量。用于实施专利技术的最佳实施方案A．本专利技术是一种用于分离冬虫夏草中所含的抗肿瘤活性馏分和活性成分的方法，其特征在于，将冬虫夏草的子实体部分干燥，再将该已干燥的子实体部分粉碎以制成干燥的粉碎试料，将该试料用水溶性溶剂提取以制成提取液，将该提取液浓缩以制成粗提取物，将该粗提取物用硅胶柱色谱法至少处理1次以分离出具有肿瘤细胞增殖抑制作用的洗脱馏分，以此作为活性馏分，然后将该活性馏分用色谱法分离纯化，获得具有肿瘤细胞增殖抑制作用的活性成分(图1A)。对于作为适用于本专利技术中的提取原料的冬虫夏草的子实体，没有特别限制，只要是能够寄生于一般公知的蝶蛾类鳞翅目和鞘翅目的昆虫及其幼虫体内并在其中形成菌核，到夏季时就形成于作为宿主的昆虫及其幼虫的躯体表面上的子实体即可。在本专利技术中，作为特别适用的冬虫夏草，可以举出那些能够寄生在蝙蝠蛾科的幼虫(Hepialus armoricanusOber)体内并在其中形成菌核，到夏季时就从该昆虫头部形成根棒状的子实体的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)。另外，在Cordyceps sinensis以外的冬虫夏草中，作为生药具有药效的冬虫夏草已知的还有Cordyceps sobolifera B和蛹虫草(Cordyceps militaris Link)和Cordyceps nutans Pat等，这些冬虫夏草也很适用于本专利技术中。只要这些冬虫夏草能够产生具有如下所述的抗肿瘤效果，就可以利用本专利技术的方法从其中提取(分离)出这些活性成分。另外，使用本专利技术的方法，可以无区别地对子实体或被子体进行提取，但是为了获得特别高的产率，优选是从冬虫夏草的子实体中提取。作为从该原料中提取分离具有抗肿瘤活性的活性馏分或活性成分的方法，可以使用通常用于从植物中提取物质的方法，对此没有特别限制，但是本专利技术在下文示出了特别好的提取分离方法。另外，在分离这些具有抗肿瘤活性的活性馏分或活性成分时使用的对该活性的判定方法也没有特别限制，可以容易地选择使用通常公知的方法。具体地说，可以选择特定的肿瘤细胞，然后根据对该细胞的增殖所起的抑制效果来进行判定。如图1A所示，本专利技术的方法一般由以下的工序构成。(1)对作为原料的冬虫夏草的子实体部分进行干燥的工序，使用该工序的原因是在作为原料的冬虫夏草的含水量非常高的情况下，在后续的提取工序中极性物质也一起被提取出来，因此在多数情况下都会对利用色谱法的分离纯化处理产生不良影响。对该干燥方法没有特别限制，但是优选使用适当大的干燥箱。另外，对干燥温度也没有特别限制，但优选是在35～60℃左右的温度范围内。在必要时优选进行送风干燥。另外，为了防止不必要的光分解，优选是在黑暗场所进行干燥。(2)通过把工序(1)中干燥了的子实体部分粉碎来制备干燥粉碎试料的工序，通过该工序可以提高后续的提取效果。对粉碎的方法没有特别限制，可以使用通常的研磨机或粉碎机进行研磨或粉碎。(3)使用溶剂来浸取在工序(2)中获得的干燥粉碎试料的工序，通过该工序可以在除去溶剂后获得粗提取物。作为适用于本专利技术中的提取溶剂，可以是水溶性溶剂或非水溶性溶剂。作为水溶性溶剂，具体地可以举出甲醇或其他低级醇，它们可以单独使用或者与缓冲液、水组合使用。另外，作为非水溶性溶剂，具体地可以举出乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等。特别优选是甲醇或乙酸乙酯，用这两种溶剂进行提取可以获得最高的回收率与提取率。(4)通过除去提取溶剂和浓缩来制备粗提取物的工序，对该工序没有特别限制，例如可以在减压下除去溶剂。另外，在必要时也可以在减压下将粗提取物干燥。(5)利用柱色谱法处理在工序(4)中获得的粗提取物以便从其中分本文档来自技高网...

【技术保护点】
冬虫夏草中的抗肿瘤活性馏分和活性成分的分离方法，其特征在于，将冬虫夏草的子实体部分干燥，再将该已干燥的子实体部分粉碎以制成干燥的粉碎试料，将该试料用水溶性溶剂提取以制成提取液，将该提取液浓缩以制成粗提取物，将该粗提取物用硅胶柱色谱法至少处理１次以分离出具有肿瘤细胞增殖抑制作用的洗脱馏分，以此作为活性馏分，然后将该活性馏分用色谱法分离纯化，获得具有肿瘤细胞增殖抑制作用的活性成分。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘台龙，后藤茂，陈肇隆，
申请(专利权)人：久光制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]