不动杆菌属溶素制造技术

针对革兰氏阴性细菌具有杀灭活性的不动杆菌属溶素多肽和变体肽。用于使用不动杆菌属溶素多肽治疗细菌性感染或细菌定殖的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】不动杆菌属溶素相关申请的交叉引用本PCT申请要求2014年6月26日提交的美国临时申请序列号62/017,618的优先权，所述美国临时申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。序列表本申请以引用的方式整体并有2015年6月24日创建，并且与此一起电子提交，题为″235932-373399_Sequence_Listing_ST25″的序列表(57KB)。领域包含对不动杆菌属(Acinetobacter)具有特异性的噬菌体溶解酶的组合物和用于治疗不动杆菌属感染的方法。背景鲍氏不动杆菌-乙酸钙复合体(Acinetobacterbaumannii-calcoaceticuscomplex)和这个种类的其它成员常常在无伤害下定殖于人皮肤。然而，由刮擦、创伤或手术对皮肤所致的损伤可导致不动杆菌属感染创伤、血液、软组织和中枢神经系统。鉴于＞80％的不动杆菌属种也具有多重抗药性(MDR)(至少三类抗生素)，这些感染可导致不利临床结果，包括高致病率和致死率、医院停留延长和大量健康护理费用。军事人员和运动员具有增加的将易受不动杆菌属种感染的损伤(从皮肤磨损直至重度创伤)的风险，因此用以将它们快速和有效移除的方法将减少或消除下游并发症。由MDR不动杆菌属引起的暴发已在全世界的医院中被报道；更新近地，它们已成为军事医学机构中的严重问题。由于它的MDR，所以不动杆菌属感染难以治疗，因此由这些生物体达成的感染通常导致不良结果。因此，需要控制这个病原体的新的和更好方式。现已报道对所有已知抗生素都具有抗性的鲍氏不动杆菌菌株。与这个出现的抗性概况协同起作用的是鲍氏不动杆菌具有在整个医院环境中持续延长时期存活的离奇能力，由此增强它达成医院扩散的能力。所述生物体通常以在皮肤完整性和气道保护方面具有缺口的病危住院受试者为目标。因此，医院获得性肺炎仍然是由鲍氏不动杆菌引起的最常见感染。然而，近来，涉及中枢神经系统、皮肤和软组织以及骨的感染已作为某些机构的高度问题性感染而出现。由于这个抗性问题，所以必须开发用以控制这些病原体的新方法。已鉴定称为噬菌体编码溶素(lysin)的抗微生物剂。噬菌体是感染细菌的病毒，并且据估计存在106个不同噬菌体种类。噬菌体溶素通常具有属特异性或种特异性，即金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)噬菌体溶素可仅针对金黄色葡萄球菌具有活性，从而提供靶向治疗方法。在一些情况下，溶素可具有针对若干属或种的活性。噬菌体感染它们的宿主细菌以产生更多病毒粒子。在繁殖周期结束时，它们面临一个问题，即如何释放圈闭在细菌内的子代噬菌体。它们通过产生称为″溶素″的酶来解决这个问题，所述酶降解受感染细菌的细胞壁以释放子代噬菌体。溶解系统由穿孔素(holin)和至少一种能够降解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶或溶素组成。通常，穿孔素在噬菌体感染的晚期表达，从而在细胞膜中形成孔，允许溶素到达细胞壁肽聚糖，导致子代噬菌体释放。值得注意的是，外源添加的溶素在不存在穿孔素下可溶解健康未感染细胞的细胞壁，从而产生称为″自外溶解(lysisfromwithout)″的现象。概述我们近来已鉴定、纯化和表征特异性攻击不动杆菌属细菌的若干噬菌体溶素。这是一个突破，因为大多数溶素仅针对革兰氏阳性细菌具有抗细菌活性。本专利技术的纯化噬菌体溶素充分适合于多种应用，诸如治疗细菌性感染和消毒。附图简述图1A.显示从鲍氏不动杆菌菌株1790诱导的噬菌体的负染色电子显微照片。图1B.显示从鲍氏不动杆菌菌株1794诱导的噬菌体的负染色电子显微照片图1C.显示从鲍氏不动杆菌菌株1796诱导的噬菌体的负染色电子显微照片图2.使包埋在琼脂中的活体鲍氏不动杆菌清亮的溶素克隆活性的代表性图像。图3.显示以下四类溶解活性的克隆溶素的氨基酸序列的示意图：i)糖基水解酶家族，ii)噬菌体基板溶菌酶，iii)溶菌酶自溶素，和iv)溶素。图4.克隆溶素的核苷酸序列的比对。图5.克隆溶素的氨基酸序列的比对。图6.是显示21个克隆构建体针对13个不同鲍氏不动杆菌临床分离株的溶解活性的图。图7A和7B.在用F307处理之后观察到来自鲍氏不动杆菌细胞的含有胞质内含物的细胞质膜的起泡(箭号)。图8.在用F307多肽处理之前和之后，鲍氏不动杆菌菌株1791的3天生物膜的扫描电子显微照片。图9.是显示在用F307多肽处理之后，具有不动杆菌生物膜的整个导管块段上的细菌计数降低的图。图10.是显示相对于对照，用F307多肽处理的被鲍氏不动杆菌感染的小鼠的存活率的图。图11.F307、不具有以及具有短延伸部分(P307Ex)的P307多肽的序列。图12.图12A是比较P307、P307SQ-8C和P307AE-8针对鲍氏不动杆菌菌株#1791、S5和ATCC17978的体外杀细菌活性的图。图12B显示P307、P307SQ-8C和P307CS-8针对鲍氏不动杆菌菌株#1791和S5的比较体内杀细菌活性。图12C显示P307SQ-8C和P307CS-8针对鲍氏不动杆菌菌株#1791、S5和ATCC17978的比较体内杀细菌活性的比较。图13.用以探究pH最优值(13A)和NaCl最优值(13B)的P307和P307SQ-8C针对鲍氏不动杆菌菌株#1791的体外杀细菌活性。除变量之外的相同条件与50mMTris-HCl(pH7.5)一起用于测定浓度最优值(13C)和杀灭动力学(13D)。误差棒显示标准偏差，并且黑色水平线标记检测限。图14.是显示不同细菌物种对P307和P307SQ-8C的敏感性的图。误差棒显示标准偏差，并且黑色水平线标记检测限。图15.图15A和15B是显示P307和P307SQ-8C针对对数期和静止期鲍氏不动杆菌菌株1791号(15A)和生物膜期(15B)的杀细菌活性的图。图16.图16显示如通过B细胞存活(16A)和溶血(16B)度量的P307和P307SQ-8C的细胞毒性作用。图17.图17A显示DTT在0、0.1和1mM下对P307和P307SQ-8C的活性的影响。图17B显示用丙氨酸取代P307SQ-8C的末端半胱氨酸残基(P307SQ-8A)的影响。图18.是显示对照肽和P307的变动的DNA变动凝胶。图19.图7A-C显示鲍氏不动杆菌菌株1791号的代表性透射电子显微术图像：未处理对照(19A)，用300μg/mLP307SQ-8C处理5分钟(19B)和2小时(19C)。放大倍数，×2600(左侧，比例尺＝2μm)和×5000(右侧顶部和底部，比例尺＝0.5μm)。图7D显示P307SQ-8C在pH7.5和8.8下对革兰氏阴性细菌肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌的杀细菌活性。图20.显示用P307和P307SQ-8C处理的鲍氏不动杆菌菌株#1791和S5的膜可渗透性。图21.显示由羟基自由基清除剂硫脲和厌氧条件对P307或P307SQ-8C的杀细菌活性的抑制。图22.显示用多粘菌素B和P307SQ-8C治疗皮肤感染的作用。详述本专利技术提供具有抗细菌活性的多肽和用于使用所公开多肽的方法。除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式″一个″、″一种″和″所述/该″包括复数个提及物。诸如″包含(comprises/comprised/comprising)″、″含有(co本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽或多肽的片段，所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.26 US 62/017,6181.一种多肽或多肽的片段，所述多肽包含与氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由与氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成，或所述多肽的片段，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。3.一种多肽或多肽的片段，所述多肽包含与氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽由与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21具有至少80％序列同一性的氨基酸组成，或所述多肽的片段，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。5.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽由具有SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21的氨基酸组成，或所述多肽的片段，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。6.根据权利要求3、4或5中任一项所述的多肽，其中所述抗微生物肽以任何顺序包含8个氨基酸C、S、Q、R、S、E和S。7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述抗微生物肽具有氨基酸序列SQSRESQC(SEQIDNO：44)或CSQRQSES(SEQIDNO：50)。8.根据权利要求3、4或5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO：45或SEQIDNO：51。9.根据权利要求3至8中任一项所述的多肽或片段，其中使...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·菲斯彻蒂，R·施库驰，R·鲁德，B·温内，
申请(专利权)人：洛克菲勒大学，
类型：发明
国别省市：美国,US