本发明专利技术涉及一种伏马毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途。该亲和柱利用伏马毒素特异性核酸适配体共价结合在载体上。偶联后的伏马毒素适配体复合载体装填亲和柱。该亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的伏马毒素的纯化，以便于后期对样本中伏马毒素的高效液相色谱（HPLC）检测和荧光检测。
A fumonisin aptamer affinity column and preparation method and application system
The invention relates to a preparation method of fumonisin aptamer affinity column and preparation and use. The affinity column aptamer covalently bound on the carrier by fumonisin specific nucleic acid. Fumonisins after coupled aptamer affinity column composite carrier loaded. The affinity column is mainly used for food, feed, milk, blood purification and other fumonisins in the sample, in order to facilitate the post of high performance liquid chromatography in samples of fumonisins (HPLC) detection and fluorescence detection.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种伏马毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。
技术介绍
伏马毒素(Fumonisins)是一组主要由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。伏马毒素在自然界中分布广泛,且危害性大,逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前,已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、B、C、P四类。研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症(EL-EM),神经性中毒而表现意识障碍、失明和运动失调等症状,严重者甚至造成死亡。对猪造成肺水肿综合征(PPE),并能造成肝脏和食道损伤。伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变,诱发大鼠肝癌。与人类食道癌的发生也密切相关。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。伏马毒素污染的主要是玉米及其制品,此外还有一些如大米、高粱、小米、牛奶、啤酒等食品。目前世界各地关于伏马毒素污染的报导较多,其中玉米及其制品的污染占了大部分。高含量的伏马毒素在很多国家和地区的玉米及玉米制品中都有报道,如韩国、中国、巴西、尼日利亚、南非、英国、法国和意大利。中国四川、浙江、河南等省份也有伏马毒素污染情况的调查,阳性检出率都较高。有调查在2005年从河南、湖北、广东、四川、广西、吉林等6个省市收集了282份玉米样品进行检测。99.6%的样品表现伏马毒素阳性,平均污染含量为6662ng/g。基于伏马毒素的污染范围较广,毒性作用也较基于伏马毒素的污染范围较广,毒性作用也较大,许多国家和地区对伏马毒素进行了系统研究。但目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。瑞典规定人类食物中伏马毒素的限量为1mg/kg,美国食品与药品管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素的最高限量指导性公告,规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为2mg/kg。同时,FDA的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的最高限量指导性公告,规定其限量范围为1~50mg/kg。在FAO/WHO联合会上关于食品添加剂的会议(2001年2月)中规定,伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重算FB1、FB2、FB3量不超过2ug/kg。我国对此的相关法规也正在制定中。在出入境检验检疫行业推荐标准中,液相色谱法对伏马毒素、B2的测定低限均为0.05mg/kg。目前伏马毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、酶联免疫分析法等。其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测伏马毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作,且成本低,无需价格昂贵的仪器,。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量,主观影响较大,灵敏度不高等,已远远不能满足现代检测要求。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点,适用于基层机构大量样品的筛选和普查,可以大大节省时间和费用,因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。高效液相色谱法(HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来,从而使样品中的毒素得以净化。免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song.TrendsAnaly.Chem2008.27(2)]。核酸适配体被应用于小分子的检测，专利CN105543231A中描述了一种伏马毒素的核酸适配体置换探针，被用于荧光偏振技术的分子识别原件。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种伏马毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途。在本专利技术中，筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的伏马毒素DNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到伏马毒素的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的伏马毒素适配体亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化伏马毒素效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的伏马毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。具体操作如下：本专利技术最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对伏马毒素的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，伏马毒素结合量大，纯化效率高的特点。伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法说明如下：1.选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化2.取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml1mMHCl洗涤6次，再分别用100ml超纯水洗涤3.将洗涤后的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO3，0.8MNaCl，PH8.9）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的伏马毒素适配体，室温偶联8小时4.将偶联好的伏马毒素适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次5.封闭将偶联好的伏马毒素适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.ClPH8.0，室温反应2小时6.将封闭好的伏马毒素适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次7.装柱将伏马毒素—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的伏马毒素亲和纯化柱。层析柱的结构如附图1所示。与现有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伏马毒素的适配体亲和柱，其特征在于包含有载体和伏马毒素适配体。
【技术特征摘要】
1.一种伏马毒素的适配体亲和柱，其特征在于包含有载体和伏马毒素适配体。2.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于适配体通过化学键偶联在载体上。3.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于所述的适配体是核酸适配体，更具体的是寡聚脱氧核苷酸适配体。4.根据权利要求3中所述的核酸适配体，其特征在于所述的适配体序列为序列1所描述的核酸序列。5.根据权利要求1中所描述的适配体，其特征在于适配体是经过化学修饰的适配体。6.根据权利要求5中所描述的适配体，其特征在于修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰及生物素修饰。7.根据权利要求1中所述的适配体亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶或者化学合成的固相载体。8.根据权利要求5中所述的亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶、溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶。9...
【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，
申请(专利权)人：北京美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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