生物聚合物分析设备及分析系统技术方案

本发明专利技术提供一种生物聚合物分析设备，其将电泳时生物聚合物的纳米孔通过速度延迟至能够进行单体序列解析的速度以下。前述生物聚合物分析设备具备能够容纳含有生物聚合物和电解质的溶液的两个槽(101a)、(101b)、一对电极(105a)、(105b)、具有纳米孔的薄膜(104)、以及载置于薄膜的三维结构体(103)，并且，三维结构体具有能够容纳溶液的空隙，空隙形成能够使溶液从纳米孔通过至三维结构体的上部的流路，流路在表面具有吸附生物聚合物的官能团，在至少以纳米孔为中心、以施加电压时的生物聚合物捕捉长度r为半径的半球范围内，三维结构体不会再分散于溶液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用了埋入于薄膜中的细孔的生物聚合物分析方法，特别是DNA、蛋白质的分析方法。
技术介绍
如果1分子的生物聚合物通过埋入于厚度数～数十nm程度的薄膜中的直径0.9nm～数nm程度的细孔(以下，称为纳米孔)，则纳米孔周边部的电特性会对应于生物聚合物的单体序列图案而变化为图案状。利用这一点，近年来正积极研究进行生物聚合物的单体序列解析的方法。关于纳米孔，常常以将含有电解质的溶液配置于薄膜两侧的形态使用。通过在该薄膜的表面和背面施加电压而产生电位差，从而能够使含有电解质的溶液通过纳米孔。着眼于电特性即此时产生的离子电流，以生物聚合物通过纳米孔时所观察到的离子电流的变化量根据单体种类的不同而不同为原理的方式被认为最有前景(图2)。除了离子电流之外，广泛已知以如下为原理的方式：在纳米孔部形成一对电极，利用流过该电极间的隧道电流，在生物聚合物通过纳米孔时所观测到的隧道电流量根据单体种类的不同而不同。任何方式均无需如以往那样的与生物聚合物的片段化相伴随的化学操作而能够直接读取生物聚合物。生物聚合物为DNA时是新一代DNA碱基序列解析系统，生物聚合物为蛋白质时是氨基酸序列解析系统，各自均作为能够解读比以往长得多的序列长度的系统而受到期待。作为纳米孔设备，存在生物孔和固体孔两种，生物孔使用在埋入于脂质双层膜的中心具有细孔的蛋白质，固体孔是对利用半导体加工工艺形成的绝缘薄膜加工细孔而成。就生物孔而言，通过将埋入于脂质双层膜中的改性蛋白质(耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MycobacteriumsmegmatisporinA，MspA)等)的细孔(直径1.2nm，厚度0.6nm)作为生物聚合物检测部来测量离子电流的变化量。然而，由于该细孔厚度大于单体1分子单位(作为DNA的单体的核酸的邻接距离为0.34nm)，因此对于离子电流变化量而言，多个单体分子的信息会混在一起。除了该空间分解能力不足之外，由于利用蛋白质，因此蛋白质的细孔部会因溶液条件、环境条件而变性，从而使设备劣化。从稳定性、寿命的观点出发，存在设备的稳健性低这样的课题。另一方面，就固体孔而言，可形成由石墨烯、二硫化钼那样的单分子层构成的薄膜。只要为它们的厚度，就能够确保为了读取单体1分子单位的充分的空间分解能力。此外，与蛋白质不同，具有在各种各样的溶液条件、环境条件下材料稳定，设备的稳健性高这样的优点。除此之外，能够利用半导体加工工艺来将纳米孔部并列化，从上述那样的优点出发，固体孔作为比生物孔更加优异的设备而受到关注。关于将作为生物聚合物的DNA链搬送至纳米孔的方法，最广泛使用将产生离子电流的电位差直接作为驱动力而使生物聚合物电泳的方法。然而，如图3所示，电泳导致的DNA链的纳米孔通过速度非常快，因此仅得到多个单体分子的信号混在一起的信号值，为了实现序列解析，需要使通过速度变慢的技术。具体而言，优选能够延迟至100μs/单体1分子单位以上的通过速度，但现状为0.01～1μs/单体1分子单位的通过速度，需要实现至少100倍至10000倍程度的速度延迟。如果能够如此地将通过速度变慢，则能够仅取得单体1分子的信号将成为可能。为了解决该课题，设计了各种各样的方法。研究了多种调整溶液物性的方法，例如，尝试了添加高浓度甘油而使溶液粘度的上升，增大与电泳时的DNA链的拉伸力相反方向的摩擦力，从而使纳米孔通过速度变慢的方法(非专利文献1)。此外，验证了通过在溶液中添加锂离子，使DNA链的表观负电荷减少，从而使电泳时的拉伸力变小而延迟纳米孔通过速度的方法(非专利文献2)。作为调整溶液物性以外的方法，研究了在设备侧下工夫的方法。例如，验证了对纳米孔自身下工夫的方法。作为简单的方法，已知通过使纳米孔的直径变小从而使DNA链通过纳米孔时的摩擦力增大，使纳米孔通过速度变慢的方法(非专利文献3)。此外，研究了在设备中设置新的结构体的方法。专利文献1中，公开了在以二维状流路构成的纳米孔设备中，设置二维形状的障碍物的方法。上述专利文献1中，公开了在加工有纳米孔的薄膜的两侧，设置有规则地隔开距离而配置的纳米尺寸的障碍物群(圆柱等)的结构。作为其他障碍物的例子，明示了由聚合物、树脂、无机系多孔体、小珠构成的凝胶材料。提及了由于在电泳时生物聚合物与障碍物碰撞而产生阻碍泳动的方向上的摩擦力，因此纳米孔通过速度降低。非专利文献4中，公开了作为障碍物的其他实现方法，在纳米孔上游侧设置无规则地多层层叠而成的树脂材质的纳米线群的结构。提及了利用由电泳时生物聚合物与纳米线碰撞产生的摩擦力来使纳米孔通过速度降低。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2014-074599号公报非专利文献非专利文献1：D.Fologea等人.NanoLett.,2005,5(9),1734.非专利文献2：S.W.Kowalczyk等人.NanoLett.,2012,12(2),1038.非专利文献3：R.Akahori等人.Nanotechnology,2014,25,275501.非专利文献4：A.H.Squires等人.J.A.C.S.,2013,135(44),16304.
技术实现思路
专利技术所要解决的课题以往的方法存在延迟效果不充分这样的课题。在上述添加甘油等而调整以粘度为代表的溶液物性的方法中，公开了例如以双链DNA为对象作为生物聚合物的情况，添加前后的通过时间达到延迟至多5倍的程度为止。除此之外，由于生物聚合物通过时添加物也同时通过，因此还存在单体1分子单位的不同单体种类的信号值差变小，单体种类的检测变得困难这样的课题。添加锂离子的方法中也同样，公开了例如以单链DNA为对象作为生物聚合物的情况，添加前后的延迟效果为10倍程度。以往利用障碍物进行的生物聚合物的纳米孔通过速度的延迟方法中，公开了例如以双链DNA为对象作为生物聚合物的情况，延迟效果达到15倍程度为止。因此，以生物聚合物与障碍物碰撞为原理的方法的延迟效果也不充分。因此，利用任何手法均无法将生物聚合物的纳米孔通过速度充分延迟至能够进行单体序列解析的速度以下，期待其他方法的开发。本专利技术是鉴于上述课题而完成的，其目的在于，通过导入新的延迟原理，从而提供一种将生物聚合物的纳米孔通过速度大幅地延迟化、能够稳定地进行生物聚合物中的单体序列解析的生物聚合物分析系统。用于解决课题的方法本专利技术的代表性方式是如下的生物聚合物分析设备，其具备可容纳含有生物聚合物和电解质的溶液的两个槽、分别配置于两个槽的一对电极、具有纳米孔且以经由纳米孔而连通两个槽的方式配置于两个槽之间的薄膜、以及载置于薄膜的三维结构体；并且，三维结构体具有空隙，空隙形成使溶液从纳米孔通至三维结构体之上的流路，流路的表面具有可吸附生物聚合物的官能团，在对一对电极施加电压时，在至少以纳米孔为中心、以生物聚合物捕捉长度为半径的半球范围内，三维结构体不会再分散于溶液。本说明书中，不会再分散的定义是，在与溶液接触的条件下，三维结构体的一部分不会因溶剂化、布朗运动或施加电压时的电泳等而剥离。专利技术效果根据本专利技术，通过在三维结构体中的流路表面存在吸附生物聚合物的官能团，从而在生物聚合物因电泳或扩散现象而接近至流路表面附近时，生物聚合物热力学吸附于流路表面。该吸附状态与生物聚合物在溶液内因溶剂化或电离而自由扩散的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物聚合物分析设备，其特征在于，具备：可容纳含有生物聚合物和电解质的溶液的两个槽；分别配置于所述两个槽的一对电极；具有纳米孔且以经由所述纳米孔而连通所述两个槽的方式配置于所述两个槽之间的薄膜；和载置于所述薄膜的三维结构体，并且，所述三维结构体具有空隙，所述空隙形成使所述溶液从所述纳米孔通至所述三维结构体之上的流路，所述流路的表面具有可吸附所述生物聚合物的官能团，在对所述一对电极施加电压时，在至少以所述纳米孔为中心、以下式所定义的生物聚合物捕捉长度r为半径的半球范围内，所述三维结构体不会再分散于所述溶液，r=d2μ8LDΔV]]>d：纳米孔的直径，μ：生物聚合物的电泳迁移率，L：薄膜的厚度，D：生物聚合物的扩散系数，ΔV：施加于两个电极间的电压差。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.12 JP 2014-1863341.一种生物聚合物分析设备，其特征在于，具备：可容纳含有生物聚合物和电解质的溶液的两个槽；分别配置于所述两个槽的一对电极；具有纳米孔且以经由所述纳米孔而连通所述两个槽的方式配置于所述两个槽之间的薄膜；和载置于所述薄膜的三维结构体，并且，所述三维结构体具有空隙，所述空隙形成使所述溶液从所述纳米孔通至所述三维结构体之上的流路，所述流路的表面具有可吸附所述生物聚合物的官能团，在对所述一对电极施加电压时，在至少以所述纳米孔为中心、以下式所定义的生物聚合物捕捉长度r为半径的半球范围内，所述三维结构体不会再分散于所述溶液，r=d2μ8LDΔV]]>d：纳米孔的直径，μ：生物聚合物的电泳迁移率，L：薄膜的厚度，D：生物聚合物的扩散系数，ΔV：施加于两个电极间的电压差。2.根据权利要求1所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述官能团为硅烷醇基。3.根据权利要求2所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述溶液包含具有促溶效应的硫氰酸离子即SCN-、磷酸二氢离子即H2PO4-、硫酸氢离子即HSO4-、碳酸氢离子即HCO3-、碘化物离子即I-、氯化物离子即Cl-、硝酸离子即NO3-、铵离子即NH4+、铯离子即Cs+、钾离子即K+、胍盐离子或四甲基铵离子。4.根据权利要求2所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述溶液的pH为1以上10以下。5.根据权利要求2所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述溶液的离子强度为10mM以上且为饱和氯化钾溶液的离子强度以下。6.根据权利要求1所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述官能团是电离为阳离子的官能团。7.根据权利要求6所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述电离为阳离子的官能团是伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵基、吡啶基、亚氨基、咪唑基、吡唑基或三唑基。8.根据权利要求6所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述溶液的pH为所述电离为阳离子的官能团的pKa以下。9.根据权利要求1所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述流路的截面积为所述生物聚合物的分子截面积以上且为所述空隙的最大截面积以下。10.根据权利要求1所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述流路的截面积为生物聚合物的分子截面积以上且为下式所定义的生物聚合物的平均自由程S以下，S=Dt]]>D：生物聚合物的扩散系数，t：纳米孔附近的平均滞留时间。11.根据权利要求1所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述三维结构体由表面具有可吸附所述生物聚合物的官能团的多个粒子成型。12.根据权利要求11所述的生物聚合物分析设备，其特征在于，所述成型后的粒子为非球状，在将载置于所述薄膜的粒子第1层从正上方向所述薄膜投影而成的图形中，所述成型后的粒子中心之间勾勒出正三角形的格子时的所述投影图形的面积占有率大...

【专利技术属性】
技术研发人员：后藤佑介，芳贺孝信，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：日本;JP