一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法技术

本发明专利技术提供了一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球替代常规的酶载体与玉米赤霉烯酮偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明专利技术首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与玉米赤霉烯酮偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。

Method for sensitive detection of zearalenone

The invention provides a sensitive method for the detection of zearalenone, this method uses embedded with quantum dots fluorescent microspheres instead of zearalenone coupling enzyme carrier and conventional corn, the coupling product implementation of direct competitive ELISA as the competitive antigen. In the technical route, the invention firstly based on the luminescence properties of selected quantum dots for the further design of quantum dot fluorescent microsphere technology based on embedding method, based on quantum dots fluorescent microspheres were coated by BSA and zearalenone coupling, resulting in better performance of the competitive antigen. In the technical proposal, the fluorescent microspheres entrapped by polymer quantum dots of large, so it has higher luminescent intensity, can effectively improve the detection sensitivity; moreover, due to the fluorescent microspheres with larger size, so it can be reduced to some extent and competitive antigen by the high affinity antibody package, thereby to enhance the detection sensitivity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗原检测
，进一步涉及基于荧光免疫学分析的抗原检测技术，具体涉及一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法。
技术介绍
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又称F-2毒素是一个被世界广为关注的毒素，它最初是从有赤霉病的玉米种分离得到的，主要由镰刀菌属的菌株产生，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌、黄色联孢、半裸镰孢等菌种。一般容易受到赭曲霉毒素污染的食品包括：玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率最高，为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg。玉米赤霉烯酮在结构上与内源性雌激素相似，能竞争性地与雌激素受体结合，从而造成动物体内生殖系统紊乱，严重影响动物的生殖机能。妊娠期的动物食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产、死胎和畸胎。同时，镰刀菌毒素类可引起人畜急、慢性中毒，还具有致畸、致癌和致突变的潜在危害，且在自然界分布极为广泛，被看作是同黄曲霉毒素一样自然发生的最危险的食品污染物。因此，世界各国纷纷制订真菌毒素的限量标准以防止超标毒素进入食物链。随着人们对食品安全问题关注度的提高，国内外毒素的限量标准也在不断降低，使得建立超灵敏的检测方式检测玉米赤霉烯酮对人类健康有着非常重要的意义。基于免疫学的快速筛查方法因具有通量高、检测快速、成本低等优势，近年来得到广泛的推广和应用。其中竞争酶联免疫吸附法在小分子抗原的检测中扮演了重要角色，常规竞争酶联免疫吸附法采用辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺显色作为信号源，这种简单的催化底物显色作为信号导致了常规竞争酶联免疫吸附法检测范围在μg/mL到ng/mL之间，远远满足不了食品污染检测pg/mL的检测要求。目前，用于提高直接竞争免疫学分析方法检测灵敏度的策略主要有两个方面：一是提高检测信号的灵敏度，如等离子共振免疫吸附法、化学发光免疫吸附法、拉曼散射免疫吸附法及荧光免疫吸附法等；二是降低竞争抗原与抗体的亲和力，如化学合成结构类似物及生物合成模拟表位等。在传统直接竞争酶联免疫吸附法中，竞争抗原的制备是通过将小分子半抗原与载体蛋白(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)偶联。由于载体蛋白的尺寸较小，导致竞争抗原与相应抗体的亲和力较高，无法被目标物所竞争。相对于载体蛋白，纳米颗粒具有更大的尺寸和重量，在相同的温度下，其布朗运动更慢。使用纳米颗粒作为小分子半抗原的载体可以合成出亲和力更低的竞争抗原，从而更容易被目标分析物竞争，进而获得更高的检测灵敏度。此外，使用纳米材料替代蛋白作为竞争抗原的载体，有效地规避了传统化学合成或生物合成抗原类似物的局限性，如操作复杂繁琐、费时费力以及偶然性大等。基于上述技术优势，纳米颗粒的抗原载体受到了广泛的关注，然而在载体的选择方面，既应当考虑分子层面的偶联效果，同时还应当具有良好的发光特性。近年来，量子点以其宽激发、窄发射、斯托克斯位移大和耐光漂白等优良的光学特性在免疫学分析中得到了广泛应用，有研究者尝试利用量子点代替常规载体HRP、ALP，然而实际研究中发现量子点与抗原的结合效果不理想，相应的发光性能难以保证，同时由于量子点本身性质不稳定，因此易受环境影响而发生荧光淬灭，此外，由于量子点的粒径仍相对较小，因此一方面存在分离纯化不方便的问题，另一方面仍会导致竞争抗原和抗体之间亲和力过高的现象。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，以解决现有技术中针对玉米赤霉烯酮的检测方法灵敏性较低的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中针对玉米赤霉烯酮的直接竞争ELISA法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中针对玉米赤霉烯酮的直接竞争ELISA法因竞争性抗原与抗体的亲和力过高而导致检测灵敏度较低。本专利技术要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点的发光性能难以得到保证。本专利技术要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点的化学稳定性较低。本专利技术要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点微球与玉米赤霉烯酮的偶联效果不佳。本专利技术要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点微球与玉米赤霉烯酮偶联后导致玉米赤霉烯酮的抗原抗体结合性能下降。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与玉米赤霉烯酮偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。作为优选，包括以下步骤：1)在酶标板上包被抗体；2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。作为优选，步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。在此基础上进一步优选的：所述混合均匀可以是在超声震荡条件下实现的；所述固液分离可以是通过离心实现的；固液分离取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次，洗涤后的产物可以在超纯水中于4℃保存。作为优选，所述量子点是CdSe/ZnS量子点。作为优选，所述量子点的激发波长为365nm、发射波长为540nm。作为优选，所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长540nm。作为优选，氯仿的去除是利用旋蒸实现的。作为优选，步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原。作为优选，所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％～1.2％，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。在以上的优选技术方案中，为了获得高的重复性，牛血清白蛋白采用了饱和标记。在此基础上进一步优选的：补加的次数可以是4次；所述磷酸盐缓冲液的初始浓度可以是0.04～0.06mol/L，其pH可以是5.8～6.2；每次重复补加的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的量可以相等；取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次(该洗涤步骤用于去除多余的BSA)；所述碳酸氢钠溶液的pH可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于该方法属于直接竞争ELISA法，其中与玉米赤霉烯酮偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。

【技术特征摘要】
1.一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于该方法属于直接竞争ELISA法，其中与玉米赤霉烯酮偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。2.根据权利要求1所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于包括以下步骤：1)在酶标板上包被抗体；2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。3.根据权利要求2所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。4.根据权利要求3所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述量子点是CdSe/ZnS量子点。5.根据权利要求3所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述量子点的激发波长为365nm、发射波长为540nm。6.根据权利要求3所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述标记有羧基修饰的量子...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊勇华，湛胜楠，周耀峰，黄小林，赖卫华，李响敏，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36