一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，通过在组织培养条件下，添加不同浓度的聚乙二醇(PEG8000)至培养基中，模拟干旱环境，胁迫处理30天后根据旱害指数鉴定猕猴桃资源的耐旱性，涉及果树抗性资源的筛选和评价，主要步骤包括：猕猴桃资源的组织培养；组培苗的继代培养；组培苗的PEG模拟干旱处理；旱害指数的统计分析；耐旱性的鉴定。该方法简单易操作，因选用的材料为生长一致的组培苗，能够保证鉴定结果的准确性和可靠性，快速筛选耐旱猕猴桃种质资源，也可为其他果树资源的抗性鉴定提供借鉴。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业
中的果树种质资源的鉴定方法，特别提供了一种在组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法。
技术介绍
我国是猕猴桃的原产地，也是世界猕猴桃资源的分布中心。猕猴桃是野生果树人工驯化栽培最成功的四大果树之一，富含维生素C和叶酸，风味独特，备受人们喜爱。我国的猕猴桃栽培面积和产量都居世界前列，但果实综合品质、单位产量和价格与新西兰、智利、意大利等发达国家相比，差距明显，原因之一是我国缺乏适应性强、高抗性的猕猴桃专用砧木。栽培过程中大多从美味猕猴桃(Actinidiadeliciosa)的不同株系或实生苗中选择砧木，由于砧木根系生长不完全一致、输导组织结构的差异及实生苗性状的分离和变异等因素，导致嫁接品种的果实综合品质(如果形均一性、单果重、口感等)参差不齐，价格偏低，缺乏市场竞争力，在国际竞争中处于劣势，价格偏低。嫁接是果树栽培的主要繁殖方式，砧木对于嫁接品种至关重要，选择抗性强的砧木不但可以增强对逆境(如干旱、高温、涝渍等)的适应能力，还可以促进接穗的健康生长，并提高果实的综合品质，提升市场竞争力。因此，培育抗性强、适应性广的高效砧木对于我国猕猴桃的抗性育种及产业发展都具有重要意义。猕猴桃属于肉质根系，大多分布在地下40厘米左右的深度，对干旱胁迫非常敏感。干旱胁迫不但会导致猕猴桃叶片萎蔫、脱落、茎杆干枯，严重时生长受抑制，甚至整株干枯。抗性资源的鉴定首先要明确抗性鉴定标准。20世纪90年代新西兰培育出了优良的猕猴桃砧木“凯迈”，也是世界上第一个登记注册的猕猴桃砧木品种，湖南省农科院园艺研究所于2000年引入并进行观察评比，发现“凯迈”比普通砧木具有更强的抗旱性。然而，我国目前在猕猴桃耐旱方面的研究较少，也没有制定统一的耐旱资源鉴定标准。因此，为了筛选耐旱猕猴桃资源，必须建立一套行之有效的资源鉴定方法，并以此为基础加快培育耐旱专用砧木，促进我国猕猴桃的抗性育种及产业发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法。本专利技术提供了一种耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：1)猕猴桃资源的组织培养；2)组培苗的继代培养；和3)组培苗的模拟干旱处理在培养基中添加不同浓度的聚乙二醇(优选为PEG8000)制得PEG模拟干旱培养基，并将步骤2)获得猕猴桃组培苗，接入所述PEG模拟干旱培养基中，培养观察。优选地，所述方法还包括步骤：4)旱害指数的统计分析；和5)耐旱性鉴定。优选地，所述步骤3)中组培苗的模拟干旱处理方法为：(1)PEG模拟干旱培养基的配制配制1/2MS-PEG培养基，所述1/2MS-PEG培养基中大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000，配制出含有不同浓度PEG8000的1/2MS-PEG培养基；配制固体增殖培养基，将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中(优选地体积比为1:1，更优选地各为30mL)，平衡24-72h后，将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG模拟干旱培养基中，进行组培苗的模拟干旱处理。优选地，所述固体增殖培养基为MS培养基+1.0mg/LZT(玉米素)，琼脂6-10g/L，pH5.8；或MS培养基+1.0mg/LZT+0.5mg/LGA3(赤霉素)，琼脂6-10g/L，pH5.8。优选地，所述步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：挑选前一年休眠的猕猴桃枝条，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2～3个芽点，浸泡在水中，加入0.5％(v/v)的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去，并用蒸馏水清洗3-5遍，放于大玻璃烧杯中，保持1/3水深；芽点处长出新芽后，将新芽和茎段切下(长度约2～3cm)，浸泡在75％(v/v)酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂(5％(w/v)次氯酸钠)清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉约2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：MS+0.5mg/L6-BA(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/LIBA(吲哚乙酸)，调整培养基pH值5.8；培养条件为：24±2℃，相对湿度40％，14小时光照，8小时黑暗。优选地，所述步骤2)中，组培苗的继代培养方法为：在出芽培养基中培养约3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下腋芽转入增殖培养基：MS+1.0mg/LZT(玉米素)(pH5.8)或MS+1.0mg/LZT+0.5mg/LGA3(赤霉素)(pH5.8)，实现组培苗的增殖，大约1个月后将新长出的嫩芽转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，大约每隔1个月更换一次增殖培养基。优选地，所述步骤3)中组培苗的聚乙二醇(PEG)模拟干旱处理方法为：(1)PEG模拟干旱培养基的配制先配制1/2MS-PEG培养基(大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂)，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000；再配制增殖培养基，两种培养基高温高压灭菌，之后用灭菌的量筒将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中(一般二者各30mL)，平衡48h后，在超净台上将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG干旱模拟培养基中，每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3颗，共计30颗小苗。优选地，所述步骤4)中旱害指数的统计分析方法为：干旱胁迫30天后，根据每个PEG浓度下组培苗所表现出来的受害症状进行统计分析，旱害指数(DDI)的分级标准如下：Ⅰ叶片和植株均生长正常，无旱害症状；Ⅱ叶片有轻度发黄或发褐，主要表现在叶缘或叶尖部位；Ⅲ叶片有干枯症状，叶片数量明显减少，植株矮化，生长受到抑制；Ⅳ叶片或茎段干枯，伴有叶片脱落，植株矮化，几乎不生长。依据下列公式计算各猕猴桃资源的旱害指数：DDI＝∑(x×n)/(4N)×100x--各级旱害级数值n--不同浓度下各旱害级株数的总和N--调查的总植株数。优选地，所述步骤5)中耐旱性鉴定的依据为DDI值：DDI值越大，表明旱害越严重，越不耐旱；值越小，表明旱害越轻，越耐旱；旱害指数25≤DDI＜45为耐旱资源；45≤DDI＜65为中度耐旱资源；65≤DDI＜85为旱敏感资源；85≤DDI≤100为旱极敏感资源。附图说明图1是旱害指数分级标准的示例图片。具体实施方式本专利技术针对果树抗性资源鉴定的技术难点，提供一种在组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，本专利技术操作简便，节省时间和空间，鉴定结果可靠，利用本专利技术可以快速筛选和鉴定耐旱资源，为培育耐旱猕猴桃专用砧木提供抗性材料。所述耐旱性鉴定方法包括如下步骤：1)猕猴桃资源的组织培养；2)组培苗的继代培养；3)组培苗的聚乙二醇(PEG8000)模拟干旱处理；4)旱害本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)猕猴桃资源的组织培养；2)组培苗的继代培养；和3)组培苗的模拟干旱处理在培养基中添加不同浓度的聚乙二醇(优选为PEG8000)制得PEG模拟干旱培养基，并将步骤2)获得猕猴桃组培苗，接入所述PEG模拟干旱培养基中，培养观察。

【技术特征摘要】
1.一种耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)猕猴桃资源的组织培养；2)组培苗的继代培养；和3)组培苗的模拟干旱处理在培养基中添加不同浓度的聚乙二醇(优选为PEG8000)制得PEG模拟干旱培养基，并将步骤2)获得猕猴桃组培苗，接入所述PEG模拟干旱培养基中，培养观察。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：4)旱害指数的统计分析；和5)耐旱性鉴定。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤3)中组培苗的模拟干旱处理方法为：(1)PEG模拟干旱培养基的配制配制1/2MS-PEG培养基，所述1/2MS-PEG培养基中大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000，配制出含有不同浓度PEG8000的1/2MS-PEG培养基；配制固体增殖培养基，将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中，平衡24-72h后，将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG模拟干旱培养基中，进行组培苗的模拟干旱处理。4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤(1)中，液体1/2MS-PEG培养基和固体增殖培养基体积比为1:1，更优选地各为30mL。5.如权利要求3所述的方法，其中，所述固体增殖培养基为MS培养基+1.0mg/LZT(玉米素)，琼脂6-10g/L，pH5.8；或MS培养基+1.0mg/LZT+0.5mg/LGA3(赤霉素)，琼脂6-10g/L，pH5.8。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：挑选前一年休眠的猕猴桃枝条，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2～3个芽点，浸泡在水中，加入0.5％的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去，并用蒸馏水清洗3-5遍，放于大玻璃烧杯中，保持1/3水深；芽点处长出新芽后，将新芽和茎段切下，浸泡在75％酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉约2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：MS+0.5mg/L6-BA(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/LIB...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟云鹏，方金豹，齐秀娟，陈锦永，孙雷明，林苗苗，顾红，魏翠果，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41