一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，包括步骤：将S7942 NSIIRA、S7942 NSIILA、aadA、rep‑origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再扩增收获第一菌体，提取质粒作为重组质粒；聚球藻PCC 7942的自然转化：S1、将聚球藻PCC 7942菌落转移至Bg‑11液体培养基中活化培养7天后用作接种液；S2、将接种液添加至新鲜的Bg‑11液体培养基中培养，直至聚球藻PCC 7942菌落中的第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得第一培养体系；S3、向第一培养体系中加入重组质粒并培养，直至第二菌体的OD 730稳定，获得第二培养体系；S4、将第二培养体系涂布于含有筛选抗性的Bg‑11固体培养基上并培养，直至出现转化子，获得漆酶。根据本发明专利技术的方法所获得的漆酶对染料具有良好的降解作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地讲，涉及一种利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法。
技术介绍
蓝细菌(也称为蓝藻)是一类特殊的原核微生物，其代表了地球上最古老的一种生命形态，可以直接利用太阳能、二氧化碳和水进行产氧性光合作用，具有生长速度快、光合作用效率高等优点，是一种十分理想的基因工程宿主，因此蓝细菌在生物能源、生物催化剂及高附加值化学品生产等领域具有广泛的应用前景。目前，聚球藻属是蓝细菌门最重要的种属之一，在世界范围内被广泛研究。聚球藻属是水体微藻类最丰富的成员之一(浓度可达105cells/mL～106cells/mL)，也被认为是海洋地域中CO2固定最重要的参与者，而其中聚球藻PCC7942是聚球藻属研究中非常重要的模式菌株。漆酶属于蓝多铜氧化酶家族，可作用底物范围较广，对于多种酚类化合物以及大量含氨基、羟基或羧基等基团的化合物都具有显著的催化能力，如单酚、对苯二酚、邻苯二酚、甲氧基酚、抗坏血酸、二胺化合物等。漆酶的催化机制是以分子氧作为最终电子受体，催化底物发生氧化的同时将氧一步四电子还原成水。因其催化氧化反应只需氧气，副产物只有水，是一种环保型“绿色催化剂”。基于漆酶具有独特的环境友好型催化机理，使得其在造纸业、纺织业、食品加工、生物炼制、环境保护和生物能源等方面都具有广阔的应用前景。随着世界上服装、纺织、纤维、印染等行业的转移，带动了我国染料工业的迅猛发展。中国染料工业协会提供的数据显示，染料制造业全行业的产量由2000年的25.7万吨上升至2014年的91.72万吨。染料本身的结构导致其具有较高的光稳定性及水洗稳定性，很难处理清除，纺织行业等所排出废水往往含有大量染料残余物，对环境河流危害极大。由于普通的物理化学方法治理成本高、处理效率低、往往带有二次污染等，并没有很好解决这一工业生产污染问题。因此，利用生物方法环保低耗能处理残余染料近年来得到了广泛关注。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法，该方法主要采用基因工程技术，利用聚球藻PCC7942作为宿主，以进行漆酶的制备，所获得的漆酶能够应用在染料降解领域，对染料具有良好的降解作用。为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法，包括步骤：将S7942NSIIRA、S7942NSIILA、aadA、rep-origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再进行扩增收获第一菌体，提取所述第一菌体中的质粒，作为重组质粒；聚球藻PCC7942的自然转化：S1、将聚球藻PCC7942菌落转移至第一份Bg-11液体培养基中活化培养7天后用作接种液；S2、将所述接种液添加至第二份Bg-11液体培养基中培养，直至所述聚球藻PCC7942菌落中的第二菌体的OD730达到2.0～2.5，获得第一培养体系；S3、向所述第一培养体系中加入所述重组质粒，在800lux～1000lux的光照条件下培养，直至所述第二菌体的OD730稳定，获得第二培养体系；S4、将所述第二培养体系涂布于具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基上，在1500lux～2000lux的光照条件下培养，直至出现转化子，获得所述漆酶。进一步地，所述S7942NSIIRA片段包括序列号为SEQNO:1的上游引物和序列号为SEQNO:2的下游引物；所述S7942NSIILA片段包括序列号为SEQNO:3的上游引物和序列号为SEQNO:4的下游引物；所述aadA片段包括序列号为SEQNO:5的上游引物和序列号为SEQNO:6的下游引物；所述rep-origin片段包括序列号为SEQNO:7的上游引物和序列号为SEQNO:8的下游引物；所述SLAC片段包括序列号为SEQNO:9的上游引物和序列号为SEQNO:10的下游引物。进一步地，在S4中，所述具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基中的第一筛选抗性浓度为2μL/mL～5μL/mL。进一步地，所述第一筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性。进一步地，在S4后，还包括S5：对所述转化子进行PCR验证，分离阳性克隆并以具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基作为培养基进行平板培养和/或以具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基作为培养基进行液体培养。进一步地，在S5中，所述具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基和所述具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基中的第二筛选抗性浓度均为20μL/mL～50μL/mL。进一步地，所述第二筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性。进一步地，S2具体包括：将所述接种液添加至所述第二份Bg-11液体培养基中培养，直至所述第二菌体的OD730达到0.4～0.5；使用第三份Bg-11液体培养基清洗OD730为0.4～0.5的第二菌体一次并离心收集；使用第四份Bg-11液体培养基悬浮经过清洗的所述OD730为0.4～0.5的第二菌体，直至所述第二菌体的OD730达到2.0～2.5，获得所述第一培养体系；其中，所述第四份Bg-11液体培养基的体积为所述第二份Bg-11液体培养基的体积的1/5。进一步地，在S2中，所述接种液与所述第二份Bg-11液体培养基的体积比大于5％。进一步地，所述重组质粒在-20℃下冷藏保存备用。本专利技术以聚球藻PCC7942作为宿主，使得外源漆酶的重组质粒与聚球藻PCC7942成功发生了同源交换，该重组质粒的基因进入聚球藻PCC7942的基因中，并成功出现了同源交换的转化子；而后分别利用含有高浓度筛选抗性的Bg-11固体培养基和含有高浓度筛选抗性的Bg-11液体培养基进行保种和扩增，实现了以聚球藻PCC7942作为宿主对漆酶的大量生产过程。根据本专利技术的利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法能够保证转化子稳定遗传插入片段的抗性达到20μg/mL，获得了稳定有效地遗传。根据本专利技术的利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法采用了完全不同的宿主以及方法，提供了一种全新的利用基因工程制备漆酶的方法，且该制备方法操作简单。附图说明通过结合附图进行的以下描述，本专利技术的实施例的上述和其它方面、特点和优点将变得更加清楚，附图中：图1是根据本专利技术的实施例的重组质粒的结构图。图2-图4是根据本专利技术的实施例的染料溶液被培养基上清液降解前后的光谱扫描图。图5-图7是根据本专利技术的实施例的染料溶液被培养基沉淀物降解前后的光谱扫描图。具体实施方式以下，将参照附图来详细描述本专利技术的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本专利技术，并且本专利技术不应该被解释为限制于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本专利技术的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本专利技术的各种实施例和适合于特定预期应用的各种修改。本专利技术公开了一种利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法，该方法采用基因工程，利用聚球藻PCC7942作为宿主，以进行漆酶的制备。根据本专利技术的利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法包括下述步骤：Q1、将S7942NSIIRA、S7942NSIILA、aadA、rep-origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再进行扩增收获第一菌体，提取第一菌体中的质粒，作为重组质粒，-20℃下冷藏保存备用。具体来讲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，其特征在于，包括步骤：将S7942NSIIRA、S7942NSIILA、aadA、rep‑origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再进行扩增收获第一菌体，提取所述第一菌体中的质粒，作为重组质粒；聚球藻PCC 7942的自然转化：S1、将聚球藻PCC 7942菌落转移至第一份Bg‑11液体培养基中活化培养7天后用作接种液；S2、将所述接种液添加至第二份Bg‑11液体培养基中培养，直至所述聚球藻PCC 7942菌落中的第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得第一培养体系；S3、向所述第一培养体系中加入所述重组质粒，在800lux～1000lux的光照条件下培养，直至所述第二菌体的OD 730稳定，获得第二培养体系；S4、将所述第二培养体系涂布于具有第一筛选抗性的Bg‑11固体培养基上，在1500lux～2000lux的光照条件下培养，直至出现转化子，获得所述漆酶。

【技术特征摘要】
1.一种利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法，其特征在于，包括步骤：将S7942NSIIRA、S7942NSIILA、aadA、rep-origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再进行扩增收获第一菌体，提取所述第一菌体中的质粒，作为重组质粒；聚球藻PCC7942的自然转化：S1、将聚球藻PCC7942菌落转移至第一份Bg-11液体培养基中活化培养7天后用作接种液；S2、将所述接种液添加至第二份Bg-11液体培养基中培养，直至所述聚球藻PCC7942菌落中的第二菌体的OD730达到2.0～2.5，获得第一培养体系；S3、向所述第一培养体系中加入所述重组质粒，在800lux～1000lux的光照条件下培养，直至所述第二菌体的OD730稳定，获得第二培养体系；S4、将所述第二培养体系涂布于具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基上，在1500lux～2000lux的光照条件下培养，直至出现转化子，获得所述漆酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S7942NSIIRA片段包括序列号为SEQNO:1的上游引物和序列号为SEQNO:2的下游引物；所述S7942NSIILA片段包括序列号为SEQNO:3的上游引物和序列号为SEQNO:4的下游引物；所述aadA片段包括序列号为SEQNO:5的上游引物和序列号为SEQNO:6的下游引物；所述rep-origin片段包括序列号为SEQNO:7的上游引物和序列号为SEQNO:8的下游引物；所述SLAC片段包括序列号为SEQNO:9的上游引物和序列号为SEQNO:10的下游引物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S4中...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁园梅，江东，成家杨，毛睿慈，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44