一株产CotA漆酶的枯草芽孢杆菌cjp3及其CotA漆酶和应用制造技术

本发明专利技术公开了一株产CotA漆酶的枯草芽孢杆菌cjp3及其CotA漆酶和应用。该产CotA漆酶细菌，其分类名称为枯草芽孢杆菌（

【技术实现步骤摘要】
一株产CotA漆酶的枯草芽孢杆菌cjp3及其CotA漆酶和应用
本专利技术属于应用微生物
，具体涉及一株产CotA漆酶的枯草芽孢杆菌cjp3及其CotA漆酶和应用。
技术介绍
漆酶(苯二酚氧化酶，EC1.10.3.2)是多铜氧化家族的一员，可催化氧化多种酚类和非酚类的底物，如苯酚、氯酚、二苯甲烷、苯并比、间苯二胺等。由于漆酶催化氧化的底物范围十分广泛，被应用在许多行业中，其中包括食品加工厂、造纸厂、纺织厂、涂料厂、有机化学厂。漆酶是典型的多铜氧化酶，它参与(1)单体的交联，(2)聚合物的降解，(3)芳香族化合物的开环。催化氧化非酚类化合物时，漆酶需要体系中存在介体，介体是一种小分子，在漆酶和底物之间扮演着“电子传递中间体”的角色，这些小分子在漆酶的氧化作用下，转化为稳定的自由基。它们作为氧化还原介体，在漆酶介体体系中能氧化其他不是漆酶底物的化合物。在有介体的时候，漆酶的催化性能扩展至很难被漆酶单独氧化的非酚类化合物(如多环芳烃，多氯联苯，有机磷农药)。并且天然介体的使用展现出了环境和经济友好的应用前景。这些都提高了漆酶在工业上的应用范围。漆酶主要分布在植物、真菌和细菌中。其中真菌漆酶比细菌漆酶具有更好的氧化还原能力，也有许多应用，但是真菌漆酶只在低温或者酸性条件下起作用，并且生长缓慢，糖基化难控制等缺点限制了真菌漆酶的应用。相对于真菌漆酶而言细菌漆酶具有热稳定性好，pH稳定，耐有机溶剂耐盐等特性，并且细菌体系比真菌更容易操作。造纸废水和染料废水等污染物的pH基本呈碱性，并且含有一些有机溶剂、高浓度盐等，需要酶能在此恶劣环境中仍保持活性，而细菌漆酶等这些特性刚好符合这些要求，因此细菌是一种具有工业应用的潜力候选者。CotA蛋白是芽孢杆菌属的具漆酶活性一种蛋白。但是CotA蛋白在野生菌中表达量小且不易分离纯化得到。通过重组DNA技术实现CotA的异源表达以获得大量的酶制剂能有效避免上述缺陷，实现CotA蛋白的大量工业生产。随着分子生物学的发展，许多漆酶基因已经被克隆和表达，研究漆酶基因表达调控机制有助于阐明不同基因在发育进程中所起的作用。通常在大肠杆菌和酵母中表达细菌漆酶，但是真菌表达生长周期慢，操作没有大肠杆菌方便，表达量也没有大肠杆菌系统高。目前应用最广泛、技术最成熟的表达系统就是大肠表达系统，但是大肠杆菌表达系统容易产生包涵体。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一株产CotA漆酶的枯草芽孢杆菌cjp3，具有产CotA漆酶的性能。本专利技术的另一目的是提供一种CotA漆酶，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)cjp3。本专利技术还有一目的是提供一CotA漆酶的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一株产CotA漆酶细菌，其分类名称为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)cjp3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016408，保藏日期为2016年7月21日，保藏地址为中国武汉武汉大学。所述的枯草芽孢杆菌cjp3在制备CotA漆酶中的应用。来源于所述的枯草芽孢杆菌cjp3的CotA漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述CotA漆酶的基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。表达所述CotA漆酶的质粒或工程菌。含有所述CotA漆酶的基因的载体。所述的CotA漆酶：在pH3-9发挥作用，在30℃时催化底物ABTS的最适pH值为5.0；在20-100℃发挥功能，在pH7.0以ABTS为底物时最适反应温度为80℃；以ABTS为底物时在体积分数高达50％的有机溶剂中保持较高活性，分别为甲醇102％以上，乙醇88％以上，丙酮112％以上，二甲基亚砜94％以上。所述的CotA漆酶在染料脱色中的应用。所述的应用，所述染料包括活性蓝19，活性黑5，靛蓝胭脂红，孔雀石绿。本专利技术的枯草芽孢杆菌cjp3是从造纸厂黑液中分离获得的。分离方法为：先将黑液加入无机盐培养基培养1天，取菌液采用稀释平板法加入固体筛选培养基中，筛选培养基组分为：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.2g/L，CaCl20.1g/L，FeSO40.05g/L，MnSO40.02g/L。取平板上的单菌落在LB平板上划线培养得到纯的单菌落，最后用ABTS颜色检测产漆酶的菌株。该菌株为革兰氏阳性菌，圆形，规则，低突起，有芽孢，表面皱褶，呈白色，菌落表面湿润。提取枯草芽孢杆菌cjp3的基因组DNA，常规PCR方法获得其16SrDNA序列如SEQIDNO.5所示。在NCBI数据库中进行同源序列分析，所得结果被鉴定为一株新的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)cjp3。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1)提供菌株使从黑液中筛选得到，提供的重组漆酶操作成熟简便，得到的酶活较高，所制备的CotA漆酶具有广泛的pH和温度催化范围，在碱性、高温条件，高盐和高浓度有机溶剂下具有较好的稳定性，比真菌漆酶适用性更强。2)可在pH值3-9.0范围内发挥作用，催化不同底物的最适pH值有所不同：以ABTS为底物时，在pH4.2时酶活最高。本专利技术的重组漆酶在碱性条件下有很好的稳定性，在pH9.0的条件下30℃保温10小时活性损失不大，这一特点是绝大多数真菌漆酶所不具备的，由于造纸工业很多采用碱法制浆，使造纸废水碱性较高，该CotA漆酶可以在碱性下稳定的发挥作用。3)本专利技术的CotA漆酶的酶促反应温度范围较广，其最适温度为80℃，在20-80℃间可保持较高的活性，这说明废水温度在波动范围较大时，漆酶仍能稳定工作。这种重组漆酶在高温下较好的稳定性在工业上具有很大的实际应用价值。在50℃和60℃时漆酶热稳定性较好，50℃处理10h后的漆酶酶活达到125.60％，而60℃的漆酶仍有74.64％，80℃重组酶的酶活在10h后还剩18.38％。4)本专利技术的CotA漆酶对金属离子具有一定的耐受性，除了Cu2+以外，重组酶在所有测试金属离子中相对稳定。Ca2+和K+对漆酶没有明显的影响。Zn2+和Cu2+分别抑制了漆酶活性61％和14％。本专利技术的CotA漆酶对抑制剂的耐受性也比较好，1mM的L-cysteine抑制了73％的酶活，1mM的SDS促进了漆酶的酶活，0.5mol/L的NaCl对所述重组漆酶的活性有一定的促进作用，在1mol/L的NaCl存在时可保持原始活性的77.84％。5)本专利技术的CotA漆酶在高浓度的有机溶剂存在下，仍可保持较高的活性。在体积分数高达50％的有机溶剂中可保持较高活性，分别为甲醇(102.75％)，乙醇(88.85％)，丙酮(112.55％)，二甲基亚砜(94.28％)。有机溶剂的使用可提高某些化合物在水中的溶解性，有利于漆酶催化降解难溶于水的有机污染物。通常情况下，使用有机溶剂会导致漆酶活性的降低。本专利技术CotA漆酶对高浓度的有机溶剂表现出较好的耐受性，可在催化降解难溶性有机污染物中发挥较大的作用。6)本专利技术CotA漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。在介体乙酰丁香酮的参与下，在pH6.2时对RB19、RB5、靛蓝胭脂红、孔雀石绿6h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产CotA漆酶细菌，其分类名称为枯草芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
2016.07.25 CN 20161059393731.一株产CotA漆酶细菌，其分类名称为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）cjp3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016408，保藏日期为2016年7月21日，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌cjp3在制备CotA漆酶中的应用。3.来源于权利要求1所述的枯草芽孢杆菌cjp3的CotA漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。4.编码权利要求3所述CotA漆酶的基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔维川，褚靖萍，夏昊，谢震宇，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32