一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法技术

本发明专利技术涉及一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，属于植物组织包埋切片技术领域，包括（1）样品取材固定、（2）软化、（3）脱水、（4）置换、（5）渗透、（6）包埋、（7）修块、（8）切片、（9）展片、粘片、（10）染色等步骤；该方法综合石蜡切片包埋和树脂渗透包埋两种包埋切片方法的特点，整合应用，取长补短，研究开发出新型系统地目前解决了甘蔗侧芽细胞学研究的切片问题，且制出的切片完整，几乎没有破碎，可达到兼顾整体与细节的切片包埋效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，属于植物组织包埋切片

技术介绍
植物组织包埋切片技术是生物制片技术中最常用的一种技术。由于其能够切成较薄而连续的切片，植物解剖学者主要用其观察细胞组织和器官的形态，制成永久装片保存。包埋切片技术最为常用的为石蜡切片包埋和树脂渗透包埋。其中石蜡切片包埋步骤包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、透明、染色等，树脂切片包埋步骤包括取材、固定、后固定、脱水、置换、树脂渗透、包埋、切片与染色等。利用以上两种方法，已有一些针对不同植物组织开发的包埋切片技术。如CN201210043067.4开发的一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法，CN201210408507.1提供一种花生籽仁的石蜡切片方法及其论文《树脂包埋技术在纤维截面切片中的应用》在丙烯酸类树脂包埋剂的特性基础上，研究了一种基于预聚技术的树脂快速包埋技术，等等。对于甘蔗农业科学研究者而言，甘蔗节段侧芽的发育是需要研究的重要对象之一，传统大多使用石蜡切片进行研究，也有国外文献显示少量使用环氧树脂包埋后切半薄切片进行研究。对于前者而言，虽然技术成熟、可以切较大样品，但存在固定液对样品损伤过大，切片较厚（8μm），成片清晰度不高且时间冗长的缺点。后者树脂切片原属于透射电镜超薄切片的范畴，其光镜半薄切片仅用于其电镜制样的定位手段，然而由于样品固定液温和，对组织细胞变形等影响较为轻微，切片可以非常薄（0.5~1μm），配合恰当的染色液，清晰度会高过石蜡切片很多，但是存在所切样品不能过大的缺点。另外，由于甘蔗侧芽随着节数的增长，靠近基部的侧芽表层细胞木质栓质化严重，传统石蜡包埋后进行切片时往往因为切片破碎，孔洞化而无法得到满意的结果。总结来说，甘蔗侧芽细胞学研究存在着样品定位、修块麻烦，固定不完全，切片易碎，成片清晰度不佳，包埋剂浪费，无法大批量制样以供后续测量分析的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，综合石蜡切片包埋和树脂渗透包埋两种包埋切片方法的特点，整合应用，取长补短，以系统地目前解决了甘蔗侧芽细胞学研究的切片问题。为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，包括以下步骤：（1）样品取材固定：双面刀片割取新鲜采摘甘蔗各茎段上的侧芽纵切，对于稍部开始第一片全展叶片对应节段的芽算1号，按照研究需求依次向下切取，分瓶固定，每瓶放入约2ml先前准备好的2.5%戊二醛固定液；（2）软化：上一步骤约4h后，对于靠近上部的样品（约1~4号侧芽）选择继续固定，剩余侧芽将固定液抽出，缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，放入4%乙二胺水溶液，4℃下静置8~10h软化，若靠近基部侧芽过硬可适当延长固定时间30~60min；（3）脱水：将软化后的侧芽/没有经过软化步骤的嫩芽一并用缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，按照酒精浓度逐级提高20%、40%、60%、80%、100%进行脱水，每步20~25min，若当日时间过晚，可在60%酒精后直接转为70%酒精过夜，隔日继续。为保证脱水彻底，100%酒精需要三次，每次20min；（4）置换：a.对于编号较大的靠近基部的侧芽（较硬，体积较大），采取石蜡切片包埋流程，置换步骤采用二甲苯，先倒去纯酒精，加入二甲苯/酒精1:1混合液，静置30min，之后倒出换用2:1混合液，30min后换用纯二甲苯；b.对于较嫩的靠近稍部的侧芽（较软，体积较小），采取树脂切片包埋流程，置换步骤采用环氧丙烷，先倒去纯酒精，样品瓶内加入环氧丙烷/酒精1:1混合液，静置10min，之后倒出换用2:1混合液，10min后换用纯环氧丙烷，每10min更换一次纯环氧丙烷，重复三次；（5）渗透：a.对于石蜡步骤的，此为渗蜡过程，上一步的纯二甲苯，加入熔化的石蜡，温度为65~75℃，处理时间20~30min，更换熔化的石蜡，再处理20~30min，得到浸蜡的侧芽组织b.对于树脂包埋步骤的而言，将5.2步骤每一样品瓶内环氧丙烷限制体积为1ml，然后滴加0.2ml环氧树脂，混匀，静置2h，之后每小时滴加0.2ml树脂，逐级提高树脂浓度三次过后，吸去一半混合液，等比例加入另一半纯树脂，混匀静置3h，换纯树脂12h渗透，全过程至于低速摇床轻轻震荡以促进包埋剂渗透（6）包埋：采用专门设计的可分离式包埋板；a.石蜡切片而言，使用加高板；b.树脂切片而言，使用基本板；（7）修块：省去，或者仅需要轻微地将侧芽样品周边一点多余的石蜡/树脂磨去；（8）切片：石蜡包埋块而言，底座与粘木块粘合便可直接进行切片，切片厚度8μm；树脂包埋流程的样品块，其底座与基座树脂粘合便可使用玻璃刀上超薄切片机进行切片，切片厚度1μm（9）展片、粘片：a.石蜡包埋的样品在切出片子以后，使用毛笔将包含样品的蜡带轻轻挑起，放在预先洗好并滴加数滴蒸馏水的载玻片上，50℃展片、烤片30min直至切片紧密贴合载玻片，随后置入纯二甲苯脱蜡缸内静置十分钟脱去石蜡，镊子轻轻拿出脱蜡后的载玻片，依次置于100%、90%、70%、50%、30%、10%酒精进行置换，最后载玻片滴加蒸馏水进行润洗，烤片待染色；b.对于树脂切片而言，直接将超薄切片机切好的1μm厚的片子使用专用工具从水槽内挑出置于数滴蒸馏水的载玻片上，70℃烤干即可；（10）染色石蜡切片按照常规方法番红固绿复染，亦可使用树脂切片常用的TBO染色剂；树脂切片采用复染法，将上一步粘好的片子（载玻片）置于烤片台上，40℃，分别使用1%番红处理1min，洗净后0.5%TBO处理1min，最后0.5%甲基紫处理，蒸馏水洗净后烤片。步骤（1）所述的2.5%戊二醛固定液，用0.05mol/LpH7.2磷酸缓冲液或0.05mol/L二甲砷酸缓冲液配制，其中后者效果更佳，并添加1%蔗糖，配制后4℃保存；步骤（5）所述的环氧树脂，其配方为树脂包埋主剂、塑化剂、硬化剂、催化剂用量（质量）比为10:5.5:26:0.4。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术综合石蜡切片包埋和树脂渗透包埋两种包埋切片方法的特点，整合应用，取长补短，对于靠近形态学上端的甘蔗侧芽纵切样品，采取树脂包埋流程，对于中下部节段的样品采取树脂切片流程固定而后转为石蜡包埋并切片流程，同时对二者前处理过程加入软化步骤，减低后期切片破碎的概率，并采用专门设计模具，系统地解决了目前甘蔗侧芽细胞学研究的切片问题，从嫩到老，从上到下一批解决，具有很好的科研指导和实用意义。（2）通过对甘蔗侧芽组织的充分研究和大量实验数据，本专利技术对包埋切片过程中和使用材料进行针对性设计：a.固定液中加入1%蔗糖可以增加固定液的渗透作用，使得固定速度更快，而常规制样中没有采用；b.常规石蜡包埋的固定液为FAA或者Carnoy’s固定液，本专利技术创新性地使用基于树脂切片包埋流程的改进的戊二醛固定法，这样能够减少前期处理的麻烦，更重要的是戊二醛对于固定细胞蛋白有着更好的效果，而对后续用于石蜡切片也显著改善；c.采用的环氧树脂配方与传统相比有所区别，常规Spurr树脂包埋主剂、塑化剂、硬化剂、催化剂用量（质量）比为10:6:26:0.4，而本专利技术的DER736塑化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）样品取材固定：双面刀片割取新鲜采摘甘蔗各茎段上的侧芽纵切，对于稍部开始第一片全展叶片对应节段的芽算1号，按照研究需求依次向下切取，分瓶固定，每瓶放入约2ml先前准备好的2.5%戊二醛固定液；（2）软化：上一步骤约4h后，对于靠近上部的样品选择继续固定，剩余侧芽将固定液抽出，缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，放入4%乙二胺水溶液，4℃下静置8~10h软化，若靠近基部侧芽过硬可适当延长固定时间30~60 min；（3）脱水：将软化后的侧芽/没有经过软化步骤的嫩芽一并用缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，按照酒精浓度逐级提高20%、40%、60%、80%、100%进行脱水，每步20~25min，若当日时间过晚，可在60%酒精后直接转为70%酒精过夜，隔日继续,为保证脱水彻底，100%酒精需要三次，每次20min；（4）置换：a. 对于编号较大的靠近基部的侧芽，采取石蜡切片包埋流程，置换步骤采用二甲苯，先倒去纯酒精，加入二甲苯/酒精1:1混合液，静置30min，之后倒出换用2:1混合液，30min后换用纯二甲苯；b. 对于较嫩的靠近稍部的侧芽，采取树脂切片包埋流程，置换步骤采用环氧丙烷，先倒去纯酒精，样品瓶内加入环氧丙烷/酒精1:1混合液，静置10min，之后倒出换用2:1混合液，10min后换用纯环氧丙烷，每10min更换一次纯环氧丙烷，重复三次；（5）渗透：a. 对于石蜡步骤的，此为渗蜡过程，上一步的纯二甲苯，加入熔化的石蜡，温度为65~75℃，处理时间20~30min，更换熔化的石蜡，再处理20~30min，得到浸蜡的侧芽组织；b. 对于树脂包埋步骤的而言，将5.2步骤每一样品瓶内环氧丙烷限制体积为1ml，然后滴加0.2ml环氧树脂，混匀，静置2h，之后每小时滴加0.2ml树脂，逐级提高树脂浓度三次过后，吸去一半混合液，等比例加入另一半纯树脂，混匀静置3h，换纯树脂12h渗透，全过程至于低速摇床轻轻震荡以促进包埋剂渗透；（6）包埋：采用专门设计的可分离式包埋板；a. 石蜡切片而言，使用加高板；b. 树脂切片而言，使用基本板；（7）修块：省去，或者仅需要轻微地将侧芽样品周边一点多余的石蜡/树脂磨去；（8）切片：石蜡包埋块而言，底座与粘木块粘合便可直接进行切片，切片厚度8μm；树脂包埋流程的样品块，其底座与基座树脂粘合便可使用玻璃刀上超薄切片机进行切片，切片厚度1μm；（9）展片、粘片：a. 石蜡包埋的样品在切出片子以后，使用毛笔将包含样品的蜡带轻轻挑起，放在预先洗好并滴加数滴蒸馏水的载玻片上，50℃展片、烤片30min直至切片紧密贴合载玻片， 随后置入纯二甲苯脱蜡缸内静置十分钟脱去石蜡，镊子轻轻拿出脱蜡后的载玻片，依次置于100%、90%、70%、50%、30%、10%酒精进行置换，最后载玻片滴加蒸馏水进行润洗，烤片待染色；b. 对于树脂切片而言，直接将超薄切片机切好的1μm厚的片子使用专用工具从水槽内挑出置于数滴蒸馏水的载玻片上，70℃烤干即可；（10）染色石蜡切片按照常规方法番红固绿复染，亦可使用树脂切片常用的TBO染色剂；树脂切片采用复染法，将上一步粘好的载玻片置于烤片台上，40℃，分别使用1%番红处理1min，洗净后0.5%TBO处理1min，最后0.5%甲基紫处理，蒸馏水洗净后烤片。...

【技术特征摘要】
1.一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）样品取材固定：双面刀片割取新鲜采摘甘蔗各茎段上的侧芽纵切，对于稍部开始第一片全展叶片对应节段的芽算1号，按照研究需求依次向下切取，分瓶固定，每瓶放入约2ml先前准备好的2.5%戊二醛固定液；（2）软化：上一步骤约4h后，对于靠近上部的样品选择继续固定，剩余侧芽将固定液抽出，缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，放入4%乙二胺水溶液，4℃下静置8~10h软化，若靠近基部侧芽过硬可适当延长固定时间30~60min；（3）脱水：将软化后的侧芽/没有经过软化步骤的嫩芽一并用缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，按照酒精浓度逐级提高20%、40%、60%、80%、100%进行脱水，每步20~25min，若当日时间过晚，可在60%酒精后直接转为70%酒精过夜，隔日继续,为保证脱水彻底，100%酒精需要三次，每次20min；（4）置换：a.对于编号较大的靠近基部的侧芽，采取石蜡切片包埋流程，置换步骤采用二甲苯，先倒去纯酒精，加入二甲苯/酒精1:1混合液，静置30min，之后倒出换用2:1混合液，30min后换用纯二甲苯；b.对于较嫩的靠近稍部的侧芽，采取树脂切片包埋流程，置换步骤采用环氧丙烷，先倒去纯酒精，样品瓶内加入环氧丙烷/酒精1:1混合液，静置10min，之后倒出换用2:1混合液，10min后换用纯环氧丙烷，每10min更换一次纯环氧丙烷，重复三次；（5）渗透：a.对于石蜡步骤的，此为渗蜡过程，上一步的纯二甲苯，加入熔化的石蜡，温度为65~75℃，处理时间20~30min，更换熔化的石蜡，再处理20~30min，得到浸蜡的侧芽组织；b.对于树脂包埋步骤的而言，将5.2步骤每一样品瓶内环氧丙烷限制体积为1ml，然后滴加0.2ml环氧树脂，混匀，静置2h，之后每小时滴加0.2ml树脂，逐级提高树脂浓度三次过后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李栋梁，苏俊波，孔冉，罗炼芳，沈炜棠，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44