一种检测羊肚菌中核苷类成分的方法技术

本发明专利技术属于药食用菌分析检测领域，具体涉及一种利用HPLC同时检测羊肚菌中鸟苷、尿苷、腺苷3种核苷类成分的方法，所述方法包括如下步骤：羊肚菌粉末，加水恒温超声提取，摇匀，取上清液过水系滤头滤过，静置处理后即得待测定供试品溶液；核苷类成分对照品溶液的制备；HPLC检测羊肚菌中的核苷类成分。本发明专利技术公开的检测羊肚菌中核苷类成分的方法稳定性、重复性和精密度都很好、结果可靠、方法便捷，可为羊肚菌的质量控制提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食药用菌分析检测领域，具体涉及一种检测羊肚菌中核苷类成分的方法，特别地是利用HPLC检测羊肚菌中鸟苷、尿苷和腺苷3种核苷类成分。
技术介绍
羊肚菌(Morchellaesculenta)，是一种名贵的食药用真菌。传统中医认为羊肚菌性平，味甘寒，无毒，具有消化助食、益肠胃、化痰理气、补肾、壮阳、提神醒脑之功能，有较高的药食用价值以及广阔的开发前景。现代医学研究表明，羊肚菌子实体中含有丰富的蛋白质、核苷、脂肪酸、碳酸化合物、生物素、粗纤维等营养成分。但是，据调查，目前对羊肚菌活性成分的深入研究主要集中在对多糖的研究，而对羊肚菌中所含核苷类成分的检测鲜见报道。前期很多学者对药食用真菌中所含有的核苷类成分进行了深入研究，并发现核苷类成分具有抗肿瘤、调节中枢神经、提高免疫力、促进血液循环等药理作用。可见，羊肚菌中核苷类成分的检测对羊肚菌进行全面质量控制是非常重要的。目前，尚未有关于羊肚菌中核苷类成分含量检测的报道。关于核苷类成分的分析检测在同类珍稀药食用菌中有较多的研究，被广泛作为真菌药材的质量和品质评价指标。如2015版《中国药典》冬虫夏草质量标准以腺苷含量作为唯一的化学成分控制指标。也有较多文献对药食用真菌中核苷类成分进行了研究，但文献报道的检测核苷类成分的方法都不能直接应用于羊肚菌中核苷的检测，如将2015版《中国药典》中百令胶囊腺苷和尿苷的高效液相色谱测定方法直接应用于羊肚菌3种核苷类成分检测存在峰形不对称，基线漂移等问题；《高效液相色谱定量分析比较4种虫草药材的核苷类成分》采用0.5％磷酸溶液提取核苷类成分并测定了4种虫草类药材的尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷含量，但是将该提取方法用于提取羊肚菌中的核苷类成分结果发现核苷含量非常低。其他很多文献采用的10％甲醇提取方法应用于羊肚菌核苷提取也存在含量很低的问题。同时，专利技术人在大量的实验研究过程中发现，上述分析检测方法进行方法学考察的过程中，存在稳定性不好的问题，其RSD不能达到低于5％的检测要求，可能是样品中核苷类成分的提取和处理方法对其含量测定有很大的影响。前期文献报道了真菌类物种中核苷类物质测定时会互相转化，如《SimultaneousdeterminationofelevennucleosidesandrelatedcompoundsinCordycepsbycapillaryelectrochromatography》文章中推测室温浸渍提取所得腺苷含量较低可能是转化成了其他化合物；《冬虫夏草水提取过程中腺苷转化途径研究》结果发现不同提取方法对冬虫夏草腺苷含量具有显著影响，如在室温水提取条件下腺苷酸(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷)可以转化为腺苷，腺苷可以转化为肌苷。由此可见，样品处理过程对于准确测定药食用真菌药材中核苷类成分的含量起着非常关键的作用。
技术实现思路
为了同时检测鸟苷、尿苷和腺苷3种核苷类成分，本专利技术提供了一种HPLC检测条件，对羊肚菌中3种核苷成分能同时稳定的、精密的测定；除此外，本专利技术还提供了提取羊肚菌中核苷的方法，这对于准确测定药食用真菌药材中核苷类成分的含量是非常关键的。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：(1)供试品溶液制备：取羊肚菌粉末，加入纯水，超声提取，取上清液经水系滤头滤过，静置处理，即得待测定供试品溶液；(2)核苷混合对照品溶液制备：分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷适量，加入纯水摇匀，制成尿苷、鸟苷和腺苷的混合对照品溶液；(3)HPLC检测：将上述步骤(1)和步骤(2)所得的供试品和对照品溶液，进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用ZORBAXSB-AQ150*4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为260nm，柱温保持24～26℃之间，流速为0.8mL/min；采用梯度洗脱，流动相A为0.04M磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈；按体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：0～8min，流动相A为100％，流动相B为0％；8～45min，流动相A由100％匀速变为85％；流动相B由0％匀速变为15％。在一些实施例中，所述步骤(1)中供试品溶液制备方法为：取过3号筛的羊肚菌粉末0.2g，用10mL纯水超声提取，取上清液经水系滤头滤过，静置处理，即得待测定供试品溶液。在一些实施例中，所述步骤(1)中供试品溶液制备方法中的超声提取条件为：25～35℃超声提取30min。在一些实施例中，所述步骤(1)中供试品溶液制备方法中的静置处理方法为：放置于6℃环境下16～28h。在一些实施例中，所述步骤(2)中核苷混合对照品溶液制备方法为：分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷适量至100mL容量瓶中，用纯水溶解，加水并定容至刻度，摇匀，即得单一对照品溶液；分别精密吸取单一核苷对照品母液10.00mL于50mL容量瓶中，加入纯水稀释并定容至刻度，摇匀，制成尿苷、鸟苷和腺苷质量浓度分别为9μg/mL、8μg/mL、9μg/mL的核苷混合对照品溶液。本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术的高效液相色谱检测方法首次同时检测了羊肚菌中腺苷、尿苷和鸟苷含量，所得色谱图基线稳定，峰形良好，分离度高，能够为羊肚菌质量控制提供科学依据。2.本专利技术采用纯水在25-35℃下超声30min提取羊肚菌中核苷的方法能够准确的测定其中腺苷、鸟苷和尿苷的含量，三种核苷的加样回收率都在98～102％范围内，且RSD值在1.5％以内，能够很好的反映样品中这三种核苷的真实含量。3.本专利技术发现样品提取之后，在6℃环境下静置处理16～28h时具有很好的稳定性，其RSD值在5％以内，解决了羊肚菌核苷检测方法的稳定性问题。附图说明以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中U、A、G分别为尿苷、腺苷和鸟苷：图1为羊肚菌核苷类成分不同提取方法的核苷含量的结果图，其中①～⑨分别为：①水提取，30℃超声提取30min，料液比1:50；②0.5％H3PO3提取，30℃超声提取30min，料液比1:50；③20％甲醇提取，30℃超声提取30min，料液比1:50；④水提取，25℃超声提取25min，料液比1:75；⑤0.5％H3PO3提取，35℃超声提取25min，料液比1:75；⑥20％甲醇提取，35℃超声提取25min，料液比1:75；⑦水提取，浸渍提取50min，料液比1:100；⑧0.5％H3PO3提取，浸渍提取50min，料液比1:100；⑨20％甲醇提取，浸渍提取50min，料液比1:100。图2为羊肚菌不同提取溶剂的核苷含量的结果图，其中，提取溶剂分别为10％甲醇，20％甲醇，40％甲醇，60％甲醇，80％甲醇，90％甲醇，100％甲醇，0.5％H3PO3，0.05MNa2HPO4，0.02MPBS(磷酸盐缓冲液)，沸水。图3为羊肚菌核苷水提液在6℃环境下静置36个小时之内供试品样品所含核苷类成分稳定性变化趋势结果图。图4为羊肚菌水提液在图3中16～28h之内核苷类成分稳定性变化的放大趋势图。图5为羊肚菌核苷20％甲醇提取液在6℃环境下静置36个小时之内供试品样品所含核苷类成分稳定性变化趋势结果图。图6为羊肚菌核苷水提液在室温环境下静置36个小时之内供试品样品所含核苷类成分稳定性变化趋势结果图。图7为核苷混合物对照品和供试品溶液的HPLC色谱图(从下往上分别为核苷混本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测羊肚菌中核苷类成分的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)供试品溶液制备：取羊肚菌粉末，加入纯水，超声提取，取上清液经水系滤头滤过，静置处理，即得待测定供试品溶液；(2)核苷混合对照品溶液制备：分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷适量，加入纯水摇匀，制成尿苷、鸟苷和腺苷的混合对照品溶液；(3)HPLC检测：将上述步骤(1)和步骤(2)所得的供试品和对照品溶液，进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用ZORBAX SB‑AQ150*4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为260nm，柱温24～26℃，流速为0.8mL/min；采用梯度洗脱，流动相A为0.04M磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈；按体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：0～8min，流动相A为100％，流动相B为0％；8～45min，流动相A由100％匀速变为85％；流动相B由0％匀速变为15％。

【技术特征摘要】
1.一种检测羊肚菌中核苷类成分的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)供试品溶液制备：取羊肚菌粉末，加入纯水，超声提取，取上清液经水系滤头滤过，静置处理，即得待测定供试品溶液；(2)核苷混合对照品溶液制备：分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷适量，加入纯水摇匀，制成尿苷、鸟苷和腺苷的混合对照品溶液；(3)HPLC检测：将上述步骤(1)和步骤(2)所得的供试品和对照品溶液，进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用ZORBAXSB-AQ150*4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为260nm，柱温24～26℃，流速为0.8mL/min；采用梯度洗脱，流动相A为0.04M磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈；按体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：0～8min，流动相A为100％，流动相B为0％；8～45min，流动相A由100％匀速变为85％；流动相B由0％匀速变为15％。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建桥，李春红，艾中，李文佳，李文庆，钱正明，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，乳源南岭好山好水冬虫夏草有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44