基于UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法技术

本发明专利技术提供了基于UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，通过超声处理，并用纯甲醇溶液进行提取，针对生物碱成分的化学性质，采用酸水溶解甲醇提取物，并进一步碱化，使生物碱盐转变为游离的生物碱，利用二氯甲烷溶液进行萃取，用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测；采用OSI/SMMS软件完成未知代谢物定性。本发明专利技术首次采用UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS技术对石斛中生物碱成分进行定性检测，共鉴定出22种生物碱成分，且均首次在石斛中被分离检测出，明确了石斛生物碱成分的类型，为研究其药理作用奠定了理论基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测
，具体涉及基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS技术对石斛中生物碱成分的检测方法。
技术介绍
石斛为常用名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效。生物碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，在抗肿瘤、治疗心血管及胃肠道疾病等方面具有明显的疗效。为明确药效成分，对石斛中生物碱进行深入的化学成分分析具有重要意义。目前，石斛中研究较多的是总生物碱含量，例如徐宁等人报道了采用分光光度法对石斛中总生物碱含量进行了测定，但是该方法主要是对石斛中生物碱进行定量检测，并且是对总生物碱的量进行的检测，无法区分不同生物碱的种类。UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术是一种较为有效地、可靠地分析化合物成分的技术，例如，谢彤等人报道了基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS的黄芩中黄酮碳苷的结构表征及黄酮碳苷类成分的同分异构体的区分，为其他中药的成分分析提供参考。另外，牛增元等人报道了采用UPLC-LTQ/OrbitrapMS技术测定化妆品中抗生素、激素、邻苯二甲酸酯、农药以及孔雀石绿和结晶紫等5大类共89种化合物，说明该方法简便、快速、可靠性高。但是该技术依托于待检测样品需经过精细的预处理过程，去除待测物中杂质的干扰才能得到目标物的分析结果。由于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术非常灵敏，前期预处理过程中如果没有完全去除非目标物，则容易造成分析产生误差或错误的结论，因此，样品的前期预处理是十分重要。现有技术中，虽然有学者报道对丹参、黄芩等样品进行预处理后采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对目标物进行检测，但是，从丹参中提取鉴定丹参酮ⅡA及丹酚酸B，前期过程需要克服糖类脂类的物质的干扰；从黄芩中分离检测黄酮碳苷，提取的目的物为糖类，干扰物为蛋白脂类等物质，可见目的物的提取方法不能通用。现有技术中，还没有针对UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对石斛中生物碱的种类进行预处理方法的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS技术对石斛中生物碱成分的检测方法，使所述方法具有快速、准确、批量检测的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS检测石斛生物碱成分的方法，包括以下步骤：1)将石斛待测样品杀青后烘烤；2)将所述步骤1)烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮；3)将所述步骤2)得到的石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液；4)将所述步骤3)得到的上清液进行浓缩，得到提取物干粉；5)将所述步骤4)得到的提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置；6)将所述步骤5)静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相；7)将所述步骤6)得到的二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉；8)将所述生物碱干粉用甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品；9)用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰；10)用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析。优选的，所述步骤1)中杀青的温度为100～110℃；杀青的时间为15～25min。优选的，所述步骤1)中烘烤的温度为50～65℃；所述烘烤至恒重。优选的，所述步骤2)中石斛的质量与有机溶剂的体积比为(50～80)mg：(1～2)mL。优选的，所述步骤3)中超声的温度为25～30℃；超声的时间20～40min；所述超声的功率为100～150W。优选的，所述步骤3)和步骤8)中所述固液分离采用离心的方法；所述离心的转速为8000～12000rpm；所述离心的时间为10～15min。优选的，所述步骤4)和步骤7)中浓缩独立为氮气吹干浓缩；所述浓缩的时间为40～100min。优选的，所述步骤5)中提取物干粉的质量与硫酸溶液的体积比为(7～11)mg：(1～2)mL；所述硫酸溶液的体积浓度为8％～12％。优选的，所述步骤5)中静置的时间为30～50min。优选的，所述步骤6)中碱性混合液与二氯甲烷的体积比为2～3：1～2；所述步骤6)中所述离心的转速为3500～5000rpm；所述步骤6)中所述离心时间为15～20min。优选的，所述步骤9)中色谱分离条件包括如下参数：色谱柱为HypersilGOLD液相色谱柱；所述HypersilGOLD液相色谱柱的规格为2.1mm×100mm×1.9μm；柱温为40℃；洗脱系统流动相A为体积浓度0.1％甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱的流速为0.35mL/min；进样体积为5μL；流动相梯度洗脱程序：(0,1min)，流动相A与流动相B的体积比19：1的混合液；[1min,24min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；[24min,28min)，流动相A与流动相B的体积比为1：19；[28min,28.1min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；[28.1,30min]，流动相A与流动相B的体积比为19：1。优选的，所述步骤9)中质谱检测条件包括以下参数：离子源为电喷雾离子源，正离子模式检测；鞘气，30自由单位；辅助气，6自由单位；喷雾电压，3.8kV；离子传输毛细管温度为350℃，源加热温度为350℃；母离子扫描范围：50-1000m/z，数据依赖的扫描模式，每次全扫描后采集最强的5个碎片图谱进行二级质谱扫描；碎裂方式：碰撞诱导解离，正态化能量30％，q值0.25，活化时间为30ms，动态排除时间为5s；一级质谱在m/z400时分辨率为30000，二级质谱在m/z400时分辨率为30000。本专利技术提供了基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS检测石斛生物碱成分的方法，通过超声提取，同时，根据多糖易溶于水而不溶于甲醇、乙醚、丙酮等有机溶剂的特点，用上述有机溶剂进行提取，避免了石斛中糖类物质的浸出，更有利于痕量物质生物碱成分的提取。本专利技术针对生物碱成分的化学性质，采用酸水溶解甲醇提取物，并进一步碱化，使生物碱盐转变为游离的生物碱，利用二氯甲烷溶液进行萃取，去除其他水溶性杂质淀粉、蛋白质、粘液质、鞣质、色素、无机盐等，更有利于生物碱成分的分离和检测。本专利技术采用具有大规模代谢组快速、准确、批量定性分析的OSI/SMMS软件，完成未知代谢物定性。本专利技术首次采用UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS技术对石斛中生物碱成分进行检测并定性，共鉴定出22种生物碱成分，且均首次在石斛中被分离检测出，进一步明确了石斛生物碱成分的类型，为研究其药理作用奠定了理论基础。附图说明图1为实施例1中铁皮石斛类原球茎的提取物正离子模式下总离子流图；图2为实施例2中m/z225.19556提取离子流色谱图；图3为实施例2中m/z225.19556一级质谱图；图4为实施例2中m/z225.19556二级质谱图。具体实施方式本专利技术提供了基于UP本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，包括以下步骤：1)将石斛待测样品杀青后烘烤；2)将所述步骤1)烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮；3)将所述步骤2)得到的石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液；4)将所述步骤3)得到的上清液进行浓缩，得到提取物干粉；5)将所述步骤4)得到的提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置；6)将所述步骤5)静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相；7)将所述步骤6)得到的二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉；8)将所述生物碱干粉用甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品；9)用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰；10)用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析。

【技术特征摘要】
1.基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS检测石斛生物碱成分的方法，包括以下步骤：1)将石斛待测样品杀青后烘烤；2)将所述步骤1)烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮；3)将所述步骤2)得到的石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液；4)将所述步骤3)得到的上清液进行浓缩，得到提取物干粉；5)将所述步骤4)得到的提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置；6)将所述步骤5)静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相；7)将所述步骤6)得到的二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉；8)将所述生物碱干粉用甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品；9)用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰；10)用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中杀青的温度为100～110℃；杀青的时间为15～25min。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中烘烤的温度为50～65℃；所述烘烤至恒重。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中石斛的质量与有机溶剂的体积比为(50～80)mg：(1～2)mL。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中超声的温度为25～30℃；超声的时间20～40min；所述超声的功率为100～150W。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤7)中浓缩独立为氮气吹干浓缩；所述浓缩的时间为40～100min。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中提取物干粉的质量与硫酸溶液的体积比为(7～11)mg：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：金青，焦春燕，蔡永萍，林毅，郑思炎，宋程，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34